構(gòu)建新型核酸探針原位延伸基因芯片的研究.pdf

1、前言: 基因芯片的發(fā)明對生命科學研究起到了巨大的推動作用，其高通量、并行化檢測的特點在基因分型、基因診斷等方面具有獨特的優(yōu)勢。目前應(yīng)用基因芯片進行分型的過程一般是：1、DNA陣列的構(gòu)建；2、樣品DNA或mRNA的制備；3、分子雜交；4、雜交圖譜的檢測和分析。 在研究過程中發(fā)現(xiàn)基因芯片也存在許多不足之處：1.基因芯片的步驟復(fù)雜，對操作者要求較高；2.芯片雜交后，樣品DNA與芯片上的探針結(jié)合穩(wěn)定性不好，清洗時容易造成樣品DN

2、A脫落，影響雜交信號強度；3.用基因芯片進行單堿基多態(tài)分析時，對探針的設(shè)計和雜交條件要求及其嚴格。 為了解決以上幾個方面的問題，本研究構(gòu)建了新型的“核酸探針原位延伸基因芯片”。該芯片解決了基因芯片操作步驟繁瑣的問題，提高了基因芯片的準確性和特異性，并且可專門用于單個堿基多態(tài)的檢測。該芯片在設(shè)計探針時將基因序列的變異位點作為探針序列的3’端，設(shè)計了4條序列一樣，3’末端分別為A，T，C，G的探針，然后將探針固定到芯片上。反應(yīng)時，首

3、先在溶液中進行樣品DNA的PCR擴增，當樣品DNA達到一定的濃度即可與芯片表面的探針進行PCR延伸反應(yīng)。此時，探針3’末端與樣品DNA不完全配對的探針點不發(fā)生延伸反應(yīng)，探針與樣品DNA結(jié)合不穩(wěn)定，而兩者完全配對的探針點經(jīng)過延伸后，結(jié)合穩(wěn)定。反應(yīng)完成后經(jīng)過清洗檢測信號即可知樣品DNA序列在探針3’位點的堿基類型。本研究為了保證實現(xiàn)以上的反應(yīng)過程，制作了專門用于該基因芯片反應(yīng)的空氣變溫PCR擴增儀和原位延伸基因芯片盒。本研究為了驗證了“核酸

4、探針原位延伸基因芯片”的準確性和可靠性，用該基因芯片對乙型肝炎病毒進行了基因分型。 實驗方法: 一、實驗材料 臨床血清標本來自中國醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)院檢驗科PCR試劑盒(NEB生物工程公司)VentR-(exo-)DNA聚合酶DDH20瓊脂糖凝膠回收試劑盒PCR擴增儀(Germany)生物芯片點樣儀(Micro Grind Ⅱ 600，Biorobtics Ltd，England)激光共聚焦掃描儀(Gene TA

5、CTM LS IV,Genomic Solutions Inc．USA)空氣變溫PCR擴增儀和原位延伸基因芯片盒(實驗室自制)。 二、實驗方法 1、應(yīng)用生物信息學軟件設(shè)計引物和HBV基因分型探針，并且分析其特異性。 2、制備基因芯片：處理片基，按預(yù)先設(shè)計好的微陣列點陣使用生物芯片點樣儀將探針點到芯片上，水化，烘烤固定并且與基因芯片盒組裝備用。 3、用酚-氯仿法提取HBV DNA模板。 4、將樣品進

6、行擴增并測序。 5、用核酸探針原位延伸基因芯片進行分型，并摸索出最優(yōu)分型條件。 6、重復(fù)芯片檢測過程檢測芯片的重復(fù)性，7、將基因芯片的分析結(jié)果與測序結(jié)果進行比較，驗證基因芯片的準確性和可靠性。 結(jié)果： 1、引物和探針序列設(shè)計合理，與其它病毒、細菌等無同源性，并且各基因型之間有很好的特異性。 2、構(gòu)建了新型的核酸探針原位延伸基因芯片。 3、新型基因芯片的HBV基因型分析結(jié)果與測序結(jié)果一致，驗