基因芯片載體的表面化學(xué)處理及核酸固定技術(shù)研究.pdf

1、核酸固定技術(shù)是涉及到表面化學(xué)、分子生物學(xué)的交叉學(xué)科，主要包括物理吸附和化學(xué)偶聯(lián)(共價(jià)連接)兩大類。在傳統(tǒng)的固定技術(shù)中多以物理吸附為主要方式，存在著表面活性差、連接效率低、穩(wěn)定性差等缺陷。該研究將共價(jià)連接方法引入玻片的表面處理和核酸的固定中：改進(jìn)了經(jīng)典的多聚賴氨酸(poly-L-lysine)包被法；自行研制研究了兩種基于多組分多氨基化合物連接系統(tǒng)和丙烯酸-丙烯酰胺聚合物系統(tǒng)的芯片表面；將它們應(yīng)用于λ噬菌體全基因組基因芯片和SARS-Co

2、V冠狀病毒寡核苷酸芯片的制備與檢測(cè)；利用陣列引物延伸技術(shù)將優(yōu)化的芯片表面用于p53基因的SNP檢測(cè)。 研究包括以下過(guò)程： 1.多聚賴氨酸偶聯(lián)的優(yōu)化 在原有poly-L-lysine表面處理基礎(chǔ)上，在玻片表面偶聯(lián)上多聚賴氨酸聚合物分子層。這些聚合物涂層以共價(jià)鍵連接在玻片表面，經(jīng)PDITC交聯(lián)劑活化后，能將寡核苷酸以共價(jià)鍵結(jié)合的形式固定在玻片上。在此表面制備了寡核苷酸芯片，檢測(cè)其固定效率、雜交效率、重復(fù)利用性和穩(wěn)定性

3、等重要指標(biāo)，結(jié)果表明各項(xiàng)性能均優(yōu)于傳統(tǒng)的poly-L-lysine芯片表面。 2.網(wǎng)狀聚合物分子層的表面修飾 為了克服玻片平整致密的表面結(jié)構(gòu)使其探針上樣量有限、生物分子連接效率差的缺點(diǎn)，研制研究了兩種不同的方案對(duì)玻片進(jìn)行表面化學(xué)處理，一種是在玻片表面衍生樹(shù)狀分支的多組分多氨基化合物連接系統(tǒng)(Poly-Amine表面)，另一種是在玻片表面聚合上具有溶脹性的網(wǎng)格狀聚合物分子層丙烯酸-丙烯酰胺聚合物系統(tǒng)(AACA-Copoly

4、mer表面)。利用表面化學(xué)反應(yīng)將富含氨基的化合物或聚合物以共價(jià)鍵方式連接到預(yù)先硅烷化的顯微載玻片上，然后利用官能團(tuán)交聯(lián)分子活化玻片表面，使DNA能快速、穩(wěn)定地結(jié)合在玻片上。通過(guò)對(duì)固定效率的檢測(cè)獲得了兩種芯片表面上最適合的固定探針濃度、長(zhǎng)度和種類。雜交點(diǎn)陣的熒光信號(hào)強(qiáng)度高、背景低，雜交點(diǎn)圓潤(rùn)、同一性好，適合不同長(zhǎng)度的未修飾寡核苷酸芯片的制備，其中AACA-Copolymer玻片的制備流程更簡(jiǎn)單。 3.DNA芯片和Oligo芯片的檢

5、驗(yàn)研究 將所研制的兩種玻片進(jìn)一步應(yīng)用于DNA芯片和寡核苷酸芯片的制備與檢測(cè)，并在雜交過(guò)程中采用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，考察其通用性。 1)將研制的Poly-Amine和AACA-Copolymer表面用于λ噬菌體全基因組芯片的制備：采用了PCR擴(kuò)增法收集實(shí)驗(yàn)所需的探針，制備λ噬菌體全基因組芯片，用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)λ噬菌體全基因組待測(cè)樣品進(jìn)行標(biāo)記、雜交和檢測(cè)。 2)按照寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成了1

6、2條60mer的SARS-CoV寡核苷酸，并將其固定在所研制的玻片上，制備了SARS冠狀病毒寡核苷酸芯片，利用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)VeoE6細(xì)胞培養(yǎng)的SARS-CoV樣品標(biāo)記后與芯片雜交、檢測(cè)。實(shí)際應(yīng)用表明，Poly-Amine玻片和AACA-Copolymer玻片在芯片制作中通用性好，探針固定效率高，檢測(cè)靈敏性好。同時(shí)與Corning公司和Telechem公司的商業(yè)化芯片表面進(jìn)行了比較，進(jìn)一步證實(shí)了所研制芯片表面的性能。 4.

7、SNPsp53芯片的原位延伸技術(shù)研究 在研制的優(yōu)化AACA-Copolymer玻片上，以K562細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用寡核苷酸陣列引物延伸法對(duì)p53基因進(jìn)行SNPs的平行檢測(cè)。根據(jù)寡核苷酸基因芯片上延伸引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出12條p53基因第三外顯子上的SNP檢測(cè)的延伸引物，點(diǎn)樣制備成寡核苷酸基因芯片，將巢式PCR擴(kuò)增出的p53基因片段與芯片雜交，在DNA聚合酶(KlenowFragment)的介導(dǎo)下進(jìn)行熒光標(biāo)記的單堿基延伸反應(yīng)、洗

8、脫、掃描。同時(shí)p53基因片段進(jìn)行測(cè)序分析。經(jīng)熒光檢測(cè)分析，芯片經(jīng)延伸反應(yīng)后出現(xiàn)了明顯的Cy3-dUTP或Cy5-dCTP熒光標(biāo)記信號(hào)，檢測(cè)靈敏度好，結(jié)果與測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果一致。此方法可以在基因水平實(shí)現(xiàn)對(duì)p53基因的多個(gè)位點(diǎn)的高靈敏度平行檢測(cè)，是一種高效、價(jià)廉、準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模基因突變檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。 有效的核酸固定技術(shù)是基因芯片制作中關(guān)鍵技術(shù)之一，也是基因芯片大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的前提條件。該文重點(diǎn)研究了基于共價(jià)連接的