基因芯片雜交質控方法的設計研究.pdf

1、基因芯片技術是上世紀90年代興起，源于計算機集成化芯片理念的一門新技術。其實質就是利用Southern blot原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達的信息。該技術的出現為基因表達譜分析、新基因的發(fā)現、基因突變檢測、多態(tài)性分析、基因組作圖等提供了強有力的工具，使疾病的基因診斷、藥物篩選等方面取得了重大突破。然而在基因芯片技術的推廣及應用

2、中，發(fā)現其實驗結果容易受到來自芯片樣品的準備、探針的打印、芯片的雜交、芯片的雜交后清洗、熒光信號采集等多個步驟因素的影響。因此需要嚴格控制芯片的實驗流程，從而得到更科學更可信的實驗數據。 芯片實驗流程中最初始的階段是樣品的制備，也是影響后續(xù)實驗效果的首要因素。樣品（DNA或mRNA）的制備包括樣品的分離純化，擴增和標記等過程。分離純化是芯片實驗的第一步，也是最重要的一步，樣品的質量會直接影響后面實驗的效果，需要應用實驗儀器對分離

3、得到的樣品進行有效的檢測，保證得到的樣品質量。在樣品的標記過程中，目前使用最多的仍然是熒光標記。生物素標記法和放射性同位素標記法由于操作過程的復雜性和檢測的要求更高，因此相對沒有熒光標記應用的更為廣泛。傳統(tǒng)的熒光標記法有逆轉錄標記法和隨機引物延伸法，在限制性擴增的基礎上引進了通用引物限制性標記法，以及線性擴增熒光標記法。線性擴增標記因為能夠如實反映樣品的表達豐度，解決了非線性標記中出現的無法精確定量的缺陷，避免了不同基因表達豐度的微小差

4、異由于PCR的幾何擴增而擴大化，并且線性熒光標記法對核酸樣品標記時所需要的初始樣品量的波動范圍在50ng至5μg之間，遠遠少于其他標記方法，非常適合某些稀有核酸樣品的標記，因此在生物芯片的樣品標記領域逐漸得到廣泛應用。 探針的打印是將預先制備好的核酸探針置于96孔或384孔板內，以液滴的形式有序排列在經特殊處理的支持物上的過程。一個微集陣列打印系統(tǒng)需要穩(wěn)定的硬件和精確的軟件支持，從而保證芯片片基打印上的點陣能夠正確反映樣品的陣列

5、排列。而影響陣列打印效果的最主要因素就是濕度和灰塵，高密度的微集陣列必須控制這兩個因素，控制濕度以防止探針在打印過程中從樣品板或打印針的細槽中蒸發(fā)。 對芯片技術的廣泛研究建立了很多技術層面的方法來改善實驗的效果，包括芯片陣列的設計，樣品的標記方法的改進等，而樣品雜交方法的選擇則相對報道較少，其中一個原因就是Corning的CMT芯片雜交盒已經在芯片實驗領域得到廣泛應用，其實驗的操作流程即將樣品點到芯片陣列表面，調節(jié)一定的溫度，雜

6、交過夜即可。但是在芯片雜交過程中，由于液體表面張力的存在，會造成樣品液滴在陣列表面呈現不均勻的分布，常常在液滴的邊緣樣品的量要低于中間的樣品量，并且在雜交后的芯片掃描圖上常常出現邊緣效應（Edge-effect），從而影響對芯片雜交圖像的分析。目前芯片雜交可以采取一種動態(tài)循環(huán)的方法中通過樣品和芯片陣列表面進行接觸來進行雜交反應，保證陣列上液-固相雜交反應的隨機性，并且避免了液體表面張力的影響，單位體積內的樣品與單位面積的陣列反應的概率相

7、同，使得到的芯片數據更科學。 芯片的高通量一方面是是芯片技術的優(yōu)勢，另一方面也容易造成實驗中芯片結果的不準確，以及如何進行數據分析的困難：在芯片實驗過程中，選擇不同的芯片片基，不同的標記雜交方法，以及所采用的不同的芯片雜交清洗平臺，都會影響芯片實驗的結果。因此，針對影響芯片實驗的各種因素，需要對芯片實驗過程進行質量控制（Quality assurance plan），來消除外加或操作因素產生的偽信號，提高芯片數據的科學性和可信性

8、。目前的研究主要是從兩個方面來進行：一是集中于具體樣品標記方法、雜交方法等各個因素的改進，選擇合適的標準化實驗流程，來提高雜交信號的信噪比；二是結合生物信息學的思路和方法對芯片實驗結果進行更有效的數據挖掘。但是前一種思路過于集中于單一環(huán)節(jié)的研究，無法從整體角度對芯片實驗過程和數據進行科學分析，而生物信息學的數據挖掘又需要設計復雜的計算機軟件和程序，增加了生物學工作研究的難度。因此，如何能夠從芯片實驗設計的角度，來對芯片實驗整體過程進行質

9、控分析，有待于深入研究。本研究立足于芯片的質控設計，探討和研究不同的芯片質控方法在芯片探針檢測的應用，并設計一種互雜交（Cross-hybridization）的實驗方法，研究從實驗整體設計出發(fā)提高芯片實驗科學性的思路；同時在芯片雜交體系方面根據已有的實驗平臺原理，提出了夾心法的芯片雜交體系，為提高芯片重復性實驗的數據科學性和可信性提供新的實驗方法和研究思路。 本研究包括以下三個部分： 一．自雜交方法在生物芯片質控中的應

10、用 應用RD-PCR技術構建人紅白血病K562細胞正常生長情況下cDNA片段文庫，從中選擇克隆擴增，PCR產物應用Pixsys5500芯片打印儀進行點樣，然后在BIO-RAD紫外交聯(lián)儀下進行交聯(lián)固定。同時提取K562細胞的總RNA，純化后的mRNA分成兩等份，應用通用引物限制性擴增標記方法分別標記熒光Cy3和Cy5，標記后的核酸樣品和芯片進行雜交反應，然后在掃描儀下進行熒光信號的采集和數據分析。 結果發(fā)現，芯片陣列的探針

11、信號清晰，背景相對較小，在雜交時兩種相同基因片段，得到的探針信號為Cy3和Cy5紅綠兩種熒光顏色的疊加，由于兩種熒光分子的大小不同，Cy5分子摻入cDNA鏈的效率比Cy3分子低，因此在芯片雜交圖上的探針信號顯示為偏黃色。在Cy3樣品/Cy5樣品分別為4/10，6/10，和8/10的不同比例下，芯片探針的兩種熒光強度在8/10的濃度比例最為接近。因此，自雜交方法可以有效地檢測樣品的標記效率，但是通過探針的兩種熒光強度差異來評估芯片本身的質

12、量，從而用于芯片的質控，仍然需要避免不同熒光之間本身的差異；并且對于單通道的芯片實驗，由于雜交時每種熒光物質標記的樣品是單一性的和一張芯片進行雜交，因此無法應用比較兩種熒光強度的自雜交方法來對芯片的實驗效果進行檢測。 二．互雜交方法的芯片質控設計研究 分離正常培養(yǎng)的K562細胞和青蒿素處理的K562細胞，提取其單個核細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA后進行熒光標記，生成的cRNA再進行純化，純化后的兩組樣品各分成兩等份，然

13、后分別與安捷倫全基因組芯片進行雜交，操作同步驟進行，然后芯片掃描儀以及FeatureExtraction軟件進行探針熒光信號的采集，采取四分位法對探針信號強度平衡至相同的信號強度均值，達到片間標準化，然后比較每組內樣品的兩次芯片雜交結果的重復性，和四張芯片整體熒光探針的檢測率，兩兩分析兩組樣品組間以及組內兩次實驗的探針信號強度。 我們發(fā)現每兩組芯片的探針檢測率，即這兩組共同檢測出的探針數量與其探針平均數量的比值，分析芯片的探針檢

14、測重復性，在相同的樣品間的一致性明顯好過不同樣品之間的比較結果。而在四分位法標準化數據的基礎上，分析每組樣品內兩張芯片得到的探針信號強度，對照組中18235個探針被共同檢測到，而有194個探針（1．1%）成為差異探針，兩次實驗數據相關性達到0．983，在處理組有19129個探針被檢測到，有287（1．5%）成為差異探針，相關性為0．972。本研究通過對基因芯片實驗得到的數據進行交叉分析和驗證，包括探針檢測率和信號強度相關性的比較，以求能

15、夠對芯片檢測得到的數據，特別是兩組樣品具有同源性時實驗數據的整理與驗證提出新的思路和方法，提高芯片實驗數據的可信度。 三．雜交體系對基因芯片探針熒光信號的作用研究 提取人慢性髓系白血病K562細胞株的mRNA，純化后在紫外分光光度儀進行定量，純化后的mRNA應用Cy5通用引物進行限制性擴增和熒光標記。然后在分成15μL的三等份，分別在CMT芯片雜交盒，安捷倫芯片雜交儀以及GeneTac自動化雜交儀中進行和K562 cDN

16、A芯片雜交，使用安捷倫2565芯片掃描儀對雜交后的芯片結果進行掃描，分析三種不同雜交體系下的探針熒光信號強度，采用單向方差分析比較差異顯著性，并對其進行多重比較，來評價三種雜交體系對探針信號強度的影響。在此基礎上，應用自制的K562 cDNA芯片對設計的夾心法雜交體系進行驗證，在芯片雜交時將樣品置于兩張芯片間同時進行雜交反應，并應用RT-PCR技術對得到的差異表達基因進行定量分析，從而為芯片重復性實驗提供新的實驗方法和思路。 我

17、們發(fā)現將探針信號強度/背景信號強度大于等于2界定為陽性探針，利用計數資料的卡方檢驗來對陽性探針檢測率進行分析，發(fā)現其三者之間的統(tǒng)計學差異具有顯著性。同時對探針熒光強度的比較分析后發(fā)現，三種雜交體系信號強度差異具有顯著性，Agilent和GeneTac兩種雜交體系中的探針的信噪比更高。進一步研究，在我們設計的夾心法實驗得到的兩張芯片中Cy3和Cy5的熒光信號一致性非常高，同時應用RT-PCR技術對得到的差異表達基因進行定量分析，與我們芯片