人類尿苷胞苷激酶基因的功能研究.pdf

1、在該論文的第一章中主要是對人類尿苷胞苷激酶(UCK,EC 2.7.1.48)基因進行的一系列研究.UCK是能將尿苷和胞苷磷酸化成一磷酸尿苷和一磷酸胞苷的嘧啶核苷激酶,該實驗室克隆到的UCK基因表達后經(jīng)活性檢測具有磷酸化胞苷的作用,并發(fā)現(xiàn)該基因定位在細胞質中發(fā)揮它的生理作用.UCK在16種人的組織中的mRNA表達譜表明,這個基因廣泛頒在多個組織中,其中肝臟、睪丸、心臟中表達較為豐富.Northern Blot方法檢測了UCK在6對肝癌和癌

2、旁組織中的表達情況,并且半定量RT-PCR方法檢測另外30對肝癌及癌旁組織UCK的表達豐度.結果顯示,UCK在肝癌組織中比癌旁組織中的表達量明顯升高.原核表達并純化UCK蛋白,并以重組蛋白為抗原制備了兔源的多克隆抗體,用它進行肝癌及癌旁組織的表達情況及免疫組化的研究,結果顯示,蛋白水平上,UCK在肝癌組織中呈顯著上調表達趨勢.通過在不同發(fā)育階段的大鼠中檢測UCK的表達豐度,顯示UCK在大鼠胚胎期的表達量很高,隨著出生以后細胞增殖速度的減

3、慢,表達量逐漸下降.UCK有望成為顯示肝癌細胞增殖速度的一個分子標記.由于UCK在磷酸化它的生理性底物尿苷和孢苷的同時,也能將一些細胞毒性的核苷類似物磷酸化,因而在腫瘤的化療中發(fā)揮著其獨特的作用.這些核苷類似物包括6-氮尿苷、5-氟尿苷等,一旦這些化合物被磷酸化,它們就干擾一些重要的細胞生理過程.將表達UCK不同豐度的肝癌細胞進行6-氮尿苷的敏感試驗顯示,6-氮尿苷對UKC表達量較高的HepG2細胞的毒性作用強于對UCK表達量較低的L0

4、2細胞,提示UCK有可能成為臨床用藥的一個參考指標,克隆人類尿苷胞苷激酸對尋找新的嘧啶核苷類似物并研究它們的藥理活性有著重要的意義.第二章的內容是對該實驗室克隆的人類肝臟和睪丸中特異表達的基因TCP10L的功能研究.首先通過結構預測的方法,發(fā)現(xiàn)該基因中含有一個亮氨酸拉鏈結構.由于很多已知的轉錄因子都含有亮氨酸拉鏈結構,推測這個基因可能具有轉錄調節(jié)的效應.將TCP10L重組質粒瞬時轉染HEK293,SK-HEP-1和CHO細胞,采用雙熒光

5、報告基因檢測系統(tǒng)檢測轉錄活性,報告基因熒光素酶的表達在上述三種細胞中較對照組分別下降了2.6,9.8和5.5倍,當用定點突變的方法破壞TCP10L的亮氨酸拉鏈結構從而影響了蛋白的空間構象時,這種轉錄抑制效應很快喪失.實驗證明,TCP10L具有轉錄抑制活性.我們又將TCP10L與EGFP融合,將重組質粒轉染細胞,發(fā)現(xiàn)其定位在細胞核內.因此,TCP10L基因可能通過識別和結合DNA上的特異序列而發(fā)揮它的轉錄抑制效應,這種應用的實現(xiàn)有賴于它具