大豆硫苷代謝功能基因GmSOT1的遺傳轉(zhuǎn)化與功能鑒定.pdf

1、大豆[Glycine max(L.)]，雙子葉植物綱豆科大豆屬植物，為重要的糧油兼用作物。隨著全球氣候變化和農(nóng)藥過度的使用，大豆生產(chǎn)中病蟲害日益加重。為了從源頭尋找理想的大豆抗病蟲相關(guān)基因，培育抗病蟲大豆新品種，我們開展了大豆次生代謝相關(guān)的抗病蟲害基因的挖掘工作。硫代葡萄糖苷（Glucosinolate，簡稱硫苷）是一種于十字花科植物中發(fā)現(xiàn)的次生代謝產(chǎn)物，其水解產(chǎn)物具有抑制細(xì)菌、真菌增殖和抗蟲等功能。而關(guān)于大豆中硫苷抗病蟲功能的相關(guān)研究

2、報道甚少。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在大豆根瘤中存在硫苷代謝途徑，并首次從大豆根瘤中克隆出硫苷代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因—磺酸基轉(zhuǎn)移酶基因GmSOT1。而GmSOT1基因的過表達(dá)是否會增加大豆植株中的硫苷含量從而提高其抗病蟲的能力則尚未見報道。
　　雖然轉(zhuǎn)基因大豆已在全球范圍大面積種植，但其遺傳轉(zhuǎn)化仍是具體實施的難點。盡管從理論上利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入大豆可縮短大豆良種選育進(jìn)程，然而目前大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率仍極低，主要原因歸咎為:

3、1）大豆離體培養(yǎng)植株再生困難;2)實驗操作重復(fù)性差;3）受體基因型間差異明顯和轉(zhuǎn)入基因的依賴性強;4）培養(yǎng)條件復(fù)雜，這極大程度地桎梏了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行的大豆遺傳改良。因此，建立一種高效的大豆離體培養(yǎng)再生體系，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中亟待解決的一個難題。
　　本研究以大豆K06-82胚尖為起始外植體，開展了大豆高效離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化，對以大豆胚尖為受體系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行了改良，并進(jìn)

4、行了大豆GmSOT1的遺傳轉(zhuǎn)化，然后利用GUS染色、PCR檢測、Southern blot雜交等方法對轉(zhuǎn)GmSOT1基因的抗性植株進(jìn)行了分析;初步鑒定了GmSOT1基因轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲效果，同時測定了GmSOT1基因轉(zhuǎn)基因植株的酶活水平，試驗結(jié)果如下:
　　1.建立了大豆K06-82的高效、穩(wěn)定再生體系:以氯氣消毒法獲取外植體胚尖，以MSB5為基本培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)時先在附加3.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的培養(yǎng)基上光下

5、培養(yǎng)5d，再轉(zhuǎn)接至附加0.5mg/L6-BA和0.05mg/L萘乙酸(NAA)的培養(yǎng)基上，2W繼代一次;不定芽伸長培養(yǎng)基配方為:MSB5+0.2mg/L6-BA+0.3mg/L赤霉素(GA3)，2W繼代一次;不定芽生根時培養(yǎng)基配方為:1/2MSB5+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)，該方法適用于帶胚軸不定芽和不帶胚軸不定芽生根，生根效率均達(dá)到96.7％左右。
　　2.大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化:對K06-82胚尖進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時，預(yù)培養(yǎng)時

6、間以24 h為宜，最佳侵染方法是28℃、200r/min條件下侵染1h，共培養(yǎng)時乙酰丁香酮(AS)使用濃度為200μmol/L，適合大豆K06-82轉(zhuǎn)基因抗性芽生根的IBA濃度為1.2mg/L，不帶下胚軸的不定芽生根率高于攜帶下胚軸的不定芽生根率。隨后用優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化方法將GmSOT1基因轉(zhuǎn)入K06-82胚尖，遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)25.1％。
　　3.大豆GmSOT1抗性植株的分子鑒定和抗蟲性測試:利用GUS染色和PCR檢測方法，初步證