甘菊NAC基因的功能研究及對露地菊花的遺傳轉化.pdf

1、植物NAC轉錄因子是植物中所特有的一類轉錄因子，參與植物基因多種途徑的表達調控，在植物對外界的生物與非生物的脅迫應答中起到關鍵的調控作用。菊花是中國傳統(tǒng)名花，品種繁多，但在逆境如低溫、干旱、鹽堿等脅迫下，往往限制了其生長和觀賞價值。因此培育抗逆性強的菊花新品種非常必要，但由于復雜的遺傳背景，使菊花的抗逆性研究進展緩慢。甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.) Makino]是菊

2、科菊屬的二倍體植物，遺傳背景簡單，且具有較強的耐鹽堿能力。本試驗從甘菊中分離了2個NAC轉錄因子基因的cDNA全長，并對該基因進行生物信息學分析與表達模式分析，并轉入擬南芥中對其功能進行分析，以此來探討甘菊中NAC轉錄因子基因的表達模式與功能，然后將該基因轉入菊花品種----露地菊‘紐9717’中，進一步研究甘菊NAC基因的功能，以期能了解甘菊中NAC轉錄因子的作用機制及為培育抗逆性強的菊花新品系提供理論基礎。主要研究結果如下:

3、　　1.在課題組前期構建的甘菊轉錄組數據庫中搜索NAC轉錄因子基因的ESTs，采用RACE技術分別擴增得到全長為881bp和1188bp的甘菊NAC基因cDNA序列ClNAC9和ClNAC39;其中ClNAC9具有一個651bp的ORF，編碼217個氨基酸殘基;ClNAC39基因具有一個849bp的ORF，編碼283個氨基酸。保守結構域檢索及氨基酸序列比對結果顯示，這2個基因都具NAM結構域，是NAC轉錄因子家族的成員，其中ClNAC9

4、基因屬于SENU5亞家族;ClNAC39基因屬于NAP亞家族，二者都是疏水性蛋白質。
　　2.采用qRT-PCR分析ClNAC在不同非生物脅迫和激素處理的表達模式。結果表明:ClNAC9基因受高鹽、干旱、熱、ABA脅迫的誘導，不受冷及水楊酸脅迫誘導;ClNAC39基因受高鹽、干旱、熱、ABA及水楊酸的脅迫誘導，只不受冷誘導。從基因表達量變化峰值上，ClNAC9基因相對表達量明顯高于ClNA3C9。
　　3.構建植物表達載體p

5、BI121-ClNAC9和pBI121-ClNAC39，采用農桿菌介導方法轉化擬南芥(Col-0)，經卡那霉素抗性篩選及RT-PCR鑒定轉基因陽性苗。在NaCl、NaHCO3及干旱三種脅迫下兩種轉基因植株在表型明顯優(yōu)于野生型;轉基因植株的MDA含量都低于野生型植株，SOD、POD活力都高于野生型植株。實時定量PCR分析表明轉ClNAC9及ClNAC39基因的擬南芥能夠響應鹽堿和干旱的脅迫，誘導下游與脅迫相關抗性基因表達，增強了轉基因植株

6、的抗逆性。同時轉ClNAC9基因的擬南芥在表現及生理指標上都優(yōu)于轉ClNAC39基因的擬南芥。
　　4.以露地菊‘紐9717’腋芽為外植體，建立其初始培養(yǎng)。通過研究各階段影響再生諸因素的作用，建立了露地菊‘紐9717’腋芽增殖和葉盤愈傷組織再生兩種途徑的再生體系。腋芽增值系數達到3.2，愈傷組織誘導率達100％，分化率達92.％以上，生根率為100％，為露地菊‘紐9717’遺傳轉化建立的了高效穩(wěn)定的葉盤再生體系。
　　5.通

7、過根癌農桿菌介導，建立了高效的露地菊‘紐9717’遺傳轉化體系:卡那霉素濃度10mg/L為葉片最佳的抗生素篩選濃度、8mg/L為轉化苗生根的最佳選擇壓力;葉片預培養(yǎng)時間為2-3d;菌液濃度為OD600為0.6左右;侵染時間為15min或OD600為0.8侵染10min;共培養(yǎng)時間為2d，延遲培養(yǎng)3d。經PCR檢測，得到了轉ClNAC9基因的露地菊‘紐9717’植株15株及轉ClNAC39基因的露地菊‘紐9717’植株4株。經RT-PCR