DREB2B基因和RD20基因在露地菊遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、干旱是植物生長(zhǎng)過(guò)程中遇到的一種非生物脅迫，在受到干旱脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子就會(huì)調(diào)控某些與逆境或抗旱相關(guān)的基因，通過(guò)一系列的轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞起重要保護(hù)作用的蛋白質(zhì)等。RD20基因和DREB2B基因是應(yīng)答干旱脅迫時(shí)重要的調(diào)控基因，在植物應(yīng)答干旱脅迫方面扮演著重要的角色，可以激活許多逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)干旱逆境的忍耐力。磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因（PMI）是生物安全標(biāo)記基因，無(wú)抗生素或除草劑抗性，對(duì)于轉(zhuǎn)基因的植株無(wú)毒害作用。本研究采用磷酸甘

2、露糖異構(gòu)酶基因PMI為篩選標(biāo)記基因，在已建立露地菊‘火焰’離體再生體系的基礎(chǔ)上將津田蕪菁RD20基因和擬南芥誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子DREB2B基因分別轉(zhuǎn)入菊花中，并采用生物基因磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因PMI為篩選標(biāo)記基因，為實(shí)現(xiàn)具有安全標(biāo)記的抗旱性狀得到改良的菊花品種奠定基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果如下:
　　(1)克隆了津田蕪菁RD20和擬南芥DREB2B基因。RD20基因cDNA序列全長(zhǎng)為720bp，編碼239個(gè)氨基酸的成熟多肽。RD20的分

3、子量為26.9kD;等電點(diǎn)(PI)為5.10。DREB2B基因全長(zhǎng)1434bp，開(kāi)放閱讀框993個(gè)堿基，5'-UTR和3'-UTR分別為228bp和213bp，編碼330個(gè)氨基酸的成熟多肽。
　　(2)構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體:利用Gateway技術(shù)構(gòu)建pCAMBIA1301-PMI-RD20和pCAMBIA1301-PMI-DREB2B植物表達(dá)載體，經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證后，將構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，之后通過(guò)PCR驗(yàn)

4、證表明pCAMBIA1301-PMI-RD20和pCAMBIA1301-PMI-DREB2B植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。
　　(3) RD20基因和DREB2B基因露地菊‘火焰’的遺傳轉(zhuǎn)化:對(duì)植株外植體消毒處理及體外培養(yǎng)，建立露地菊‘火焰’莖段外植體的無(wú)菌再生體系，用目的基因的農(nóng)桿菌菌液侵染葉片，并以NAA與6-BA作為生長(zhǎng)激素，建立了葉片外植體再生體系。將葉片上生成的不定芽轉(zhuǎn)入1/2 MS生根篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選，