DREB2A、SCMRP基因雙價(jià)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、不良環(huán)境(如低溫、干旱、鹽漬等)作用于植物，將會(huì)引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理代謝反應(yīng)，表現(xiàn)為代謝和生長(zhǎng)的可逆性抑制，嚴(yán)重時(shí)甚至引起不可逆?zhèn)Γ瑢?dǎo)致整個(gè)植株死亡。全球有20％耕地受到鹽害威脅，43％的耕地為干旱、半干旱地區(qū)。我國(guó)鹽堿土的總面積約有3000多萬(wàn)hm2，其中已開(kāi)墾的有600多萬(wàn)hm2，還有2000多萬(wàn)hm2鹽荒地等待開(kāi)墾利用。僅黑龍江省鹽堿地就達(dá)9000余萬(wàn)畝，嚴(yán)重制約了黑龍江省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。 季節(jié)性干旱給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也造成了

2、極大的危害。我國(guó)，干旱、半干旱地區(qū)占全國(guó)土地面積的50％以上，主要集中在華北、東北、西北等糧食主產(chǎn)區(qū)。同時(shí)，低溫、冷害對(duì)植物造成的傷害也嚴(yán)重制約著我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。每年我國(guó)因?yàn)榈蜏卦斐傻募Z食減產(chǎn)也在10％左右。因此，如何改善植物的生態(tài)環(huán)境；如何提高作物的抗逆性，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)快速、可持續(xù)性發(fā)展已經(jīng)成為人們急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。 迄今為止，許多植物因?yàn)槿狈Ρ匾陌被岫绊懫淦焚|(zhì)。就苜蓿而言，多年來(lái)人們一直將其多作為牲畜所需蛋白質(zhì)和氨基酸的

3、主要來(lái)源，但是，苜蓿中含硫氨基酸的含量較低。有研究表明，豆科植物中的主要貯存蛋白是鹽溶球蛋白。而鹽溶球蛋白中較缺乏含硫氨基酸，因此，人們正試圖著用基因工程手段去提高豆科植物中含硫氨基酸的含量，以達(dá)到改善豆科植物品質(zhì)的目的。含硫氨基酸不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，也參于動(dòng)物體內(nèi)許多生理代謝活動(dòng)。此外，牧草或飼料中含硫氨基酸的含量對(duì)動(dòng)物毛發(fā)的產(chǎn)量和質(zhì)量也影響很大。因此，利用一些高含硫蛋白基因，用遺傳工程手段來(lái)提高植物蛋白中含硫氨基酸水平具有

4、十分重要的意義。 紫花苜蓿系豆科植物中較耐低溫的飼料作物，是畜牧業(yè)生產(chǎn)中的重要飼草，被譽(yù)為“牧草之王”。苜蓿不但是重要的飼料作物，更是改善土壤條件、保持水土和保護(hù)環(huán)境的重要作物。但是苜蓿蛋白質(zhì)中含硫氨基酸的含量較低，直接影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值。每年我國(guó)都要花巨額外匯從國(guó)外購(gòu)進(jìn)大量蛋氨酸混加在飼料中，所以提高苜蓿中含硫氨基酸的含量具有重要的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 本研究以紫花苜蓿為受體材料，將不同啟動(dòng)子調(diào)控的抗?jié)B透脅迫信號(hào)

5、傳導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵基因DREB2A與采用生物信息學(xué)方法改造的高甲硫氨酸蛋白基因SCMRP構(gòu)建成雙價(jià)植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿牧草品種，獲得轉(zhuǎn)基因植株。分析轉(zhuǎn)基因植株的抗?jié)B透脅迫能力、SCMRP蛋白表達(dá)情況和氨基酸組分以及生長(zhǎng)發(fā)育狀況，篩選抗低溫、干旱、鹽堿和富含甲硫氨酸的轉(zhuǎn)基因苜蓿新株(品)系。 本研究對(duì)于建立苜蓿分子育種技術(shù)體系，充分利用我國(guó)鹽堿地資源，擴(kuò)大苜蓿種植面積，提高苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣

6、闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。 主要研究結(jié)果如下所示： 1.植物表達(dá)載體構(gòu)建： (1)構(gòu)建了中間表達(dá)載體pB2SM，上面含有組成型啟動(dòng)子2×35S調(diào)控的SCMRP基因； (2)構(gòu)建植物表達(dá)載體pB2ASM，上面含有由2×35S調(diào)控的SCMRP基因和由rd29A啟動(dòng)子調(diào)控的DREB2A基因； (3)構(gòu)建植物表達(dá)載體pB2ESM，上面含有由2×35S調(diào)控的SCMRP基因和由E12啟動(dòng)子調(diào)控的DREB2A基因。

7、 2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 (1)確定了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化pB2ASM所獲得的抗性植株的抗性芽率為31％、每個(gè)外植體分化的芽數(shù)為1.20； (2)確定了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化pB2ESM所獲得的抗性植株的抗性芽率為19％、每個(gè)外植體分化的芽數(shù)為1.06。 3.抗性植株分子生物學(xué)檢測(cè) (1)獲得了轉(zhuǎn)化pB2ASM抗性植株57株，其中PCR陽(yáng)性植株為31株，PCR陽(yáng)性率為54.39％； (2)獲得了轉(zhuǎn)化p