AFP、CBF2基因表達載體的構建及其對苜蓿遺傳轉化的研究.pdf

1、低溫是限制植物分布與生長的重要因素，低溫傷害是一種嚴重的自然災害，全球每年因此造成農作物的損失高達數(shù)千億美元。苜蓿（Medicago sativa）為暖溫帶重要的牧草，對溫度反應敏感。低溫是制約其生長的主要限制因子，如何提高苜蓿的抗寒性對提高其生產力有重要的意義，利用現(xiàn)代生物學技術進行植物抗凍性分子改良具有高效性和針對性。本研究成功地從胡蘿卜和擬南芥中克隆了抗凍蛋白基因AFP和抗凍基因CBF2，并分別構建了植物表達載體并將其導入農桿菌中

2、；還針對目前農桿菌介導轉化法中存在的轉化率低的問題，對苜蓿的遺傳轉化體系進行了優(yōu)化：已通過農桿菌介導轉化法，將構建好的AFP、CBF2抗凍基因植物表達載體分別轉化到了優(yōu)良苜蓿品種中。主要成果如下：
　　 ⑴分別以胡蘿卜和擬南芥基因組DNA為模板，通過PCR方法，成功地克隆了全長1200bp的抗凍蛋白基因AFP和全長700bp的抗凍基因CBF2，轉化大腸桿菌DH5α，采用IPTG誘導，使宿主菌重組子表達特異的抗凍基因。
　　

3、 ⑵通過雙酶切，將其分別連接到PBI121工程質粒上，成功地構建了含有卡那霉素抗性選擇標記的植物表達載體P-T-AFP和P-T-CBF2，并通過直接轉化法將其導入農桿菌EHA105中。
　　 ⑶遺傳轉化體系的建立。以培養(yǎng)7天的和田苜蓿的無菌苗子葉為外植體，以農桿菌菌株為介體，預培養(yǎng)3天，侵染時間為10min，菌液濃度OD600=0.3，共培養(yǎng)3天，Kan篩選濃度定為60mg/L，脫菌過程中使用400mg/L的羧芐青霉素。