2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、第一部分 鈉氫交換子1在醛固酮所致大鼠腎小球硬化中的作用體內(nèi)研究
   目的:
   近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),醛固酮與臟器纖維化等病變密切相關(guān),并且可作為一個(gè)獨(dú)立的致病因素直接參與纖維化過(guò)程。鈉氫交換子1(NHE1)是一種糖蛋白,除了調(diào)節(jié)酸堿平衡、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)pH的作用外,目前有研究發(fā)現(xiàn)NHE1還能對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié),NHE1也被證實(shí)參與了腎臟纖維化的發(fā)生,但是在腎臟纖維化過(guò)程中醛固酮的致纖維化作用是否與NHE1有關(guān)尚不清楚。為了

2、證實(shí)NHE1在醛固酮所致大鼠腎小球硬化中的作用,我們?cè)诒静糠值难芯恐袛M通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明大鼠腎小球也是醛固酮作用的靶目標(biāo),并在體內(nèi)環(huán)境直接探討醛固酮是否參與慢性腎小球損傷的發(fā)展以及NHE1在其中的作用和相關(guān)機(jī)制。
   (一)MR和11β-HSD2在大鼠腎小球中的表達(dá)
   方法:
   用正常SD大鼠的腎臟分別制各石蠟和冰凍切片,并用篩網(wǎng)法提取腎小球蛋白,同時(shí)分別提取腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)蛋白。選擇醛固酮作用的特異性受體

3、MR和保證醛固酮和其受體特異性結(jié)合的酶11β-HSD2作為局部醛固酮系統(tǒng)存在的關(guān)鍵指標(biāo),分別用免疫組化、免疫熒光和Western blot檢測(cè)上述指標(biāo)在腎臟的分布區(qū)域和表達(dá)量。
   結(jié)果:
   1.免疫組化結(jié)果顯示陽(yáng)性11β-HSD2表達(dá)在腎皮質(zhì)的遠(yuǎn)曲小管和集合管,染色陽(yáng)性細(xì)胞在上皮細(xì)胞的胞核和胞漿中都有大量分布,但是在腎小球和近曲小管也可見(jiàn)到少量表達(dá),高倍鏡下可見(jiàn)在腎小球中的陽(yáng)性部位主要位于腎小球系膜區(qū)和近曲小管的

4、胞漿;采用免疫熒光的方法,發(fā)現(xiàn)11β-HSD2主要表達(dá)在腎臟的遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞,在腎小球也有少量表達(dá):
   2.免疫組化結(jié)果顯示陽(yáng)性MR表達(dá)在腎皮質(zhì)的遠(yuǎn)曲小管和集合管,染色陽(yáng)性細(xì)胞在上皮細(xì)胞的胞核和胞漿中都有大量表達(dá),但是在腎皮質(zhì)的腎小球和近曲小管也可見(jiàn)到少量表達(dá);采用免疫熒光的方法,用綠色熒光FITC標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)MR主要表達(dá)在腎臟的遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞,在腎小球的系膜區(qū)也有少量表達(dá);
   3.采用免疫熒光

5、的方法,用綠色熒光FITC標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)11β-HSD2和MR主要表達(dá)在腎臟的遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞,在腎小球的系膜區(qū)也有少量表達(dá):
   4.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MR在髓質(zhì)中表達(dá)量最高,在皮質(zhì)中由于有大量腎小管的存在,也有所表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)新鮮腎臟獲得的腎小球蛋白中能檢測(cè)到MR的少量表達(dá)。
   結(jié)論:
   在本部分的研究中,我們?cè)隗w內(nèi)證實(shí)大鼠腎小球內(nèi)存在MR和11β-HSD2的陽(yáng)性表達(dá),大鼠腎小球

6、也是醛固酮體內(nèi)作用的靶目標(biāo)。
   (二)鈉氫交換子1在醛固酮所致大鼠腎小球硬化中的作用體內(nèi)研究
   方法:
   用體重180-200g雄性SD大鼠建立5/6腎大部切除模型,實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)假手術(shù)組(SHAM組):(2)5/6腎切組(SNX組);(3)SNX+醛固酮組(ALDO組);(4)ALDO+NHEl抑制劑DMA組(DMA組),成模后12周處死大鼠,進(jìn)行常規(guī)血、尿生化檢測(cè)及尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定,PAS和

7、Masson染色觀察大鼠腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化程度;免疫組化和Western blot檢測(cè)各組大鼠腎組織的FN、TGF-β1和PCNA的表達(dá)情況。
   結(jié)果:
   1.成模后12周,5/6腎大部切除大鼠均出現(xiàn)明顯的高血壓,蛋白尿和腎功能?chē)?yán)重?fù)p害。和SNX組相比,ALDO組的血壓(mmHg)升高更顯著(ALDO:224±9.4 vs.SNX:194±6.36,p<0.01),蛋白尿(mg/24h)(ALDO:23

8、7.93±10.06 vs.SNX:82.76±4.65,p<0.01)和腎功能損害(血清肌酐值:μmol/L)(ALDO:123.57±11.12 vs.SNX:85.5±4.96)更嚴(yán)重,DMA組大鼠比ALDO組大鼠蛋白尿有明顯減輕(DMA:163.73±10.15 vs.ALDO:237.93±10.06,p<0.01),但是對(duì)高血壓和腎功能損害并沒(méi)有明顯的改善作用;
   2.PAS染色顯示,除SHAM組外的四個(gè)實(shí)驗(yàn)組大

9、鼠腎小球均呈局灶節(jié)段性硬化甚至全小球硬化,其中以ALDO組最為顯著;與ALDO相比,DMA組的腎小球增殖和硬化程度明顯減輕(DMA:3.1±0.176 vs.ALDO:3.35±0.15,p<0.01)。Masson染色顯示與SHAM組相比,手術(shù)實(shí)驗(yàn)組均有明顯的的腎小管間質(zhì)纖維化,伴小管擴(kuò)張和蛋白管型。ALDO組和SNX組相比,大鼠的間質(zhì)纖維化程度明顯加重(ALDO:2.225±0.1 17 vs.SNX:1.9±0.085,p<0.0

10、5),DMA對(duì)ALDO所致間質(zhì)纖維化和蛋白管型沒(méi)有明顯改善作用:
   3.免疫組化指數(shù)評(píng)分結(jié)果表明,FN在腎大部切除大鼠腎小球和小管間質(zhì)內(nèi)均有大量表達(dá),表達(dá)水平均顯著高于SHAM組。ALDO組和DMA組FN表達(dá)明顯高于SNX組(ALDO:0.733±0.04,DMA:0.725±0.062 vs.SNX:0.617±0.047,p<0.01),但是這兩組之間沒(méi)有明顯差異:
   4.免疫組化和Western blot結(jié)

11、果均提示各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)水平顯著高于SHAM組,免疫組化指數(shù)的評(píng)分結(jié)果表明,ALDO組TGF-β1表達(dá)水平高于SNX組,但是無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ALDO:0.73±0.024 vs.SNX:0.69±0.03,p>0.05),和ALDO組相比,DMA組的TGF-β1表達(dá)有所下降(DMA:0.64±0.047 vs.ALDO:0.73±0.024,p<0.01)。Western blot結(jié)果提示ALDO組TGFβ1蛋白水平比S

12、NX組進(jìn)一步升高(ALDO:431.33±19.04 vs.SNX:207.83±9.61.p<0.01)。和ALDO組相比,DMA組的TGF-β1表達(dá)有所下降(DMA:0.64±0.047 vs.ALDO:0.73±0.024,p<0.05);
   5.免疫組化和Western blot結(jié)果均提示,腎大部切除后PCNA表達(dá)明顯高于SHAM組,其中ALDO組表達(dá)最高,DMA組的PCNA表達(dá)和ALDO組相比有所下降。
  

13、 結(jié)論:
   我們的體內(nèi)研究結(jié)果提示,NHE1介導(dǎo)了醛固酮所致大鼠腎小球硬化的作用,而且不依賴于血流動(dòng)力學(xué)作用。其抑制劑DMA能顯著改善5/6腎大切動(dòng)物模型的腎小球硬化,其機(jī)理可能是通過(guò)抑制細(xì)胞外基質(zhì)的積聚以及腎小球系膜細(xì)胞的增殖。
   第二部分 醛固酮通過(guò)鈉氫交換子l誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)增生的作用探討
   目的:
   我們?cè)谇懊娴谝徊糠值捏w內(nèi)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),NHE1介導(dǎo)了醛固酮所致大鼠腎小

14、球硬化的作用,而且不依賴于血流動(dòng)力學(xué)作用。其抑制劑DMA能顯著改善5/6腎大切動(dòng)物模型的腎小球硬化,且其機(jī)理可能是通過(guò)抑制系膜細(xì)胞外基質(zhì)的積聚以及系膜細(xì)胞的增殖。由于體內(nèi)環(huán)境比較復(fù)雜,為了排除眾多體內(nèi)因素的干擾,我們?cè)诒静糠值难芯恐?選擇與腎小球硬化細(xì)胞外基質(zhì)分泌密切有關(guān)的重要固有細(xì)胞——系膜細(xì)胞,旨在探討在腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC)上醛固酮是否能夠激活NHEl,以及是否能通過(guò)NHEI誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)增

15、生。從而進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)NHE1介導(dǎo)了醛固酮所致大鼠腎小球硬化的作用。
   方法:
   體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞(MC),并進(jìn)行如下分組:對(duì)照組(普通培養(yǎng)液),醛固酮組(10-7 mol/L)(Aldo),醛固酮+安體舒通(10-9 mol/L)組(Aldo+Spir),醛固酮+NHE1抑制劑Dimethylamiloride(DMA,251μmol/L)組(Aldo+DMA)。24小時(shí)后收集培養(yǎng)上清液和各組細(xì)胞,

16、抽提總RNA。用酸負(fù)荷后鈉依賴的pHi(細(xì)胞內(nèi)pH值)的變化來(lái)檢測(cè)NHEl活性,同時(shí)采用Real-time PCR檢測(cè)NHEl基因表達(dá),采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)NHE1蛋白表達(dá);采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)成分纖連蛋白FN的蛋白表達(dá)。
   結(jié)果:
   1.與對(duì)照組相比,醛固酮組腎小球系膜細(xì)胞NHE1的活性(△pHi/100s)與對(duì)照組相比顯著增高(Cont 4.48±0.25% vs.Aldo

17、 5.29±0.11%,p<0.05),加入安體舒通和DMA后活性均有所降低(Aldo+Spir 4.92±0.35%,Aldo+DMA 4.07±0.23%,vs.Aldo 5.29±0.11%,p<0.05);
   2.Real-time PCR結(jié)果顯示Aldo組NHE1 mRNA水平有所增高,是對(duì)照組的1.16倍(p<0.05),而Aldo+Spir組NHE1的mRNA水平明顯下降,是Aldo組的81.9%(p<0.05

18、),安體舒通本身對(duì)NHEl的基因表達(dá)沒(méi)有影響;
   3.Western blot結(jié)果顯示Aldo組NHE1蛋白水平顯著增高(Cont 401.74±17.96:vs.Aldo 535.84±8.67,p<0.01),而Aldo+Spir組NHE1蛋白水平明顯下降(Aldo535.84±8.67 vs.Aldo+Spir 457.64±11.27,p<0.05),安體舒通本身對(duì)NHE1的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果與We

19、stern blot相似;
   4.ELISA方法檢測(cè)纖連蛋白(Fibronectin,FN)的水平,結(jié)果顯示Aldo組FN水平有所增高(Cont 17.84±3.77 vs.Aldo 51.66±1.40,P<0.01);和Aldo組相比,Aldo+Spir組和Aldo+DMA組FN水平(ng/ml)有所下降(Aldo+Spir 29.60±1.99,Aldo+DMA25.75±4.66,vs.Aldo 51.66±1.40

20、,p<0.01)。
   結(jié)論:
   醛固酮能夠刺激腎小球系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),其作用可能是由于醛固酮激活系膜細(xì)胞NHE1活性、上調(diào)其基因和蛋白表達(dá)所致。
   第三部分 ERK1/2通路介導(dǎo)鈉氫交換子l在醛固酮誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)增生中的作用
   目的:
   在第二部分的研究中,我們的結(jié)果提示醛固酮能夠刺激腎小球系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),其作用可能是由于醛固酮激活系膜細(xì)胞NHEl活

21、性、上調(diào)其基因和蛋白表達(dá)所致。而ERK1/2通路在腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)積聚的過(guò)程中又發(fā)揮了極為重要的作用。因此本部分研究擬通過(guò)構(gòu)建NHE1的短發(fā)夾狀RNA抑制NHE1表達(dá),從而探討ERK1/2通路是否介導(dǎo)了醛固酮通過(guò)NHE1致大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)增生的作用。
   方法:
   構(gòu)建靶向NHE1的短發(fā)夾狀雙鏈RNA的真核表達(dá)質(zhì)粒(shRNA-NHE1)并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞,分別于轉(zhuǎn)染后1天、3天

22、、4天采用熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot法從mRNA和蛋白水平觀察對(duì)NHE1的抑制作用。轉(zhuǎn)染4天成功抑制NHE1的表達(dá)后,實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)對(duì)照組:只加入培養(yǎng)液;(2)醛固酮組:培養(yǎng)液中加入醛固酮10-7 mol/L;(3)醛固酮+shRNA-NHE1組:shRNA-NHE1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染96小時(shí)后加入醛固酮10-7 mol/L:(4)醛固酮+安體舒通組:用安體舒通10-9 mol/L先孵育3小

23、時(shí)后加用醛固酮10-7 mol/L;(5)醛固酮+PD98059(ERK1/2拮抗劑)組:同時(shí)加入醛固酮10-7 mol/L和25 μM PD98059。干預(yù)24h后,分別提取各組細(xì)胞蛋白以及上清液,用于NHE1,ERK1/2和phosphor-ERK1/2的Western blot檢測(cè)以及ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞外基質(zhì)成分纖連蛋白的表達(dá)。
   結(jié)果:
   1.Real-time PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后24小

24、時(shí)shRNA-NHE1組NHE1的mRNA表達(dá)即開(kāi)始下降36.90%,轉(zhuǎn)染3天、4天后NHE1的基因表達(dá)可進(jìn)一步降低,分別下降69.2%和77.9%;
   2.Western blot顯示轉(zhuǎn)染后24小時(shí)NHE1的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(Control 426.56±12.17,Negative 434.94±23.91 vs.Iday 368.47±13.7,p>0.05);3天后蛋白水平顯著下降(negative 434.9±2

25、3.91 vs.3day 260.59±12.04,p<0.01),4天后抑制作用更明顯(negative 434.9±23.91 vs.4day 107.585±7.66,p<0.01);
   3.ELISA方法顯示在無(wú)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞中,醛固酮刺激后可導(dǎo)致上清液中FN水平明顯升高,而當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-NHE1質(zhì)粒,醛固酮的上述作用被明顯抑制(Control 17.74±1.38ng/ml,Aldo+shRNA-Ne

26、gative 51.78±1.15ng/ml vs.Aldo+shRNA-NHE1 28.07±1.73ng/ml,p<0.01):安體舒通或PD98059干預(yù)24h后也可拮抗醛固酮刺激所刺激的FN增生的作用(Aldo+Spir 29.60±.99ng/ml,Aldo+PD98059 29.82±1.39 ng/ml,vs.Aldo+shRNA-Negative 51.78±1.15ng/ml,p<0.01);
   4.Wes

27、tern blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)醛固酮刺激24h后系膜細(xì)胞NHEl的表達(dá)增強(qiáng)(Control 139.31±9.95 vs.Aldo 351.4±42.16,p<0.01)可以被PD98059所抑制(Aldo 351.4±42.16,vs.Aldo+PD98059 225.68±21.13,p<0.05);相反,醛固酮作用24h后,大鼠系膜細(xì)胞磷酸化ERK1/2的水平明顯增高(Control 280.52±33.46vs.Aldo 513.2

28、2±24.77,p<0.01),且醛固酮對(duì)ERK1/2磷酸化的激活作用在轉(zhuǎn)染shRNA-NHE1成功抑制NHE1表達(dá)后依然存在(Aldo 513.22±24.77 vs.Aldo±shRNA-NHE1 462±24.34,p>0.05)。
   結(jié)論:
   通過(guò)構(gòu)建靶向NHE1的shRNA真核表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞可以特異性抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞NHE1的表達(dá),同時(shí)顯著抑制醛固酮引起的細(xì)胞外基質(zhì)增生,且該作用可能是通過(guò)ERK

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