SIK1在糖尿病腎病大鼠腎小球早期病變中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【目的】
　　糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致終末期腎病的一個(gè)主要原因,在腎小球發(fā)生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)積聚等的纖維樣病變提示了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。在這一過程中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforminggrowthfactors-β1,TGF-β1)通過TGF-β1型受體即活化素受體樣激酶5(thetypeIactivinreceptor-likekinase(AL

2、K)5,ALK5)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而進(jìn)一步激活ECM的主要成分纖連蛋白(fibronectin,FN)和可以誘導(dǎo)ECM降解的纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogenactivatorinhibitortype1,PAI-1)的表達(dá),導(dǎo)致ECM的積聚和降解的減少。研究表明選擇性抑制ALK5對(duì)與腎小球纖維化的這種慢性腎臟疾病是一種潛在治療方法。鹽誘導(dǎo)激酶1(SaltInducibleKinase1,SIK1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,

3、SIK1可以與抑制型Smad7形成復(fù)合體并下調(diào)ALK5的表達(dá)而被認(rèn)為是TGF-β的信號(hào)通路中的一個(gè)負(fù)向調(diào)控因子。雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SIK1在大鼠腎臟高表達(dá),但SIK1在糖尿病腎臟中表達(dá)和腎小球纖維化病變之間的關(guān)系還未完全闡明,而高糖是否影響SIK1表達(dá)也鮮有報(bào)道。
　　因此,本研究應(yīng)用大鼠糖尿病模型和體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞,構(gòu)建鼠SIK1基因的真核表達(dá)載體,從整體、細(xì)胞和分子水平,系統(tǒng)研究了糖尿病腎臟及高糖環(huán)境中系膜細(xì)胞SIK1蛋

4、白表達(dá)情況及對(duì)ALK5信號(hào)通路的調(diào)控。
　　【方法】
　　1.SIK1在糖尿病腎病大鼠腎臟的表達(dá)和意義
　　將SPF級(jí)8周齡wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(normal組,10只)和糖尿病組(diabetic組,20只)。糖尿病模型采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,溶于pH值4.5的0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中,60mg/kg),對(duì)照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液,72h后尾尖取血

5、,血糖≥16.7mmol/L者確定為1型糖尿病模型。于12和16周齡糖尿病模型組取5只大鼠,乙醚麻醉大鼠,眼球內(nèi)眥取血,離心分離血清,用于測(cè)定血糖;稱重后于腹腔注射65mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,分離腎臟。于20周齡,將各組大鼠于代謝籠中,監(jiān)測(cè)24h尿量,尿白蛋白及尿肌酐(Ucr)水平,并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)和尿白蛋白排泄率(UAER)。麻醉取血,分離血清測(cè)定血糖,血肌酐及尿素氮水平。摘取腎臟,稱重,計(jì)算腎臟指數(shù)。取部分腎組織置于

6、4％多聚甲醛固定,用于HE,PAS染色觀察其病理變化情況。
　　取腎組織制備切片進(jìn)行免疫組化。分別提取腎組織及腎小球組織蛋白,應(yīng)用免疫沉淀及Westernblot方法以及觀察糖尿病大鼠腎臟SIK1蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響。并應(yīng)用Westernblot方法觀察20周齡大鼠腎小球ALK5、FN、PAI-1表達(dá)情況,Masson染色觀察20周齡大鼠腎小球膠原纖維及ECM聚集情況。
　　2.高糖刺激對(duì)系膜細(xì)胞SIK1的表達(dá)、活性、

7、細(xì)胞內(nèi)分布及ALK5信號(hào)通路的影響,SIK1表達(dá)質(zhì)粒對(duì)高糖刺激下的系膜細(xì)胞ALK5信號(hào)通路及系膜細(xì)胞增殖的影響
　　大鼠腎系膜細(xì)胞HBZY-1細(xì)胞以含有10%胎牛血清、100KU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),用高糖(30mmol/L,Highglucose,HG)制備模型,于刺激后0、12、24和48h收集細(xì)胞,免疫沉淀、Westernblot及半定量RT-PCR分別檢測(cè)SIK1表達(dá)及磷酸化水平。構(gòu)建pEG

8、FP-SIK1表達(dá)質(zhì)粒,激光共聚焦觀察高糖刺激下細(xì)胞內(nèi)生性及轉(zhuǎn)染pEGFP空質(zhì)粒及pEGFP-SIK1表達(dá)質(zhì)粒后SIK1細(xì)胞內(nèi)分布及核轉(zhuǎn)運(yùn)情況。Westernblot及免疫細(xì)胞化學(xué)觀察高糖對(duì)HBZY-1細(xì)胞ALK5信號(hào)通路的影響。
　　設(shè)計(jì)和構(gòu)建針對(duì)SIK1基因的表達(dá)質(zhì)粒,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,同步化后將細(xì)胞隨機(jī)分為3組,空白細(xì)胞對(duì)照組、pCDF1空質(zhì)粒對(duì)照組和pCDF1-SIK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,24h后細(xì)胞長(zhǎng)至70-8

9、0%時(shí)開始轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體法。48h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,終止培養(yǎng)進(jìn)行蛋白、RNA提取。Westernblot及半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIK-1蛋白和mRNA的表達(dá)。對(duì)各組轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞以高糖繼續(xù)培養(yǎng)48h,終止培養(yǎng)后以Westernblot及細(xì)胞免疫組化檢測(cè)SIK1、ALK5、FN及PAI-1表達(dá),MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　【結(jié)果】
　　1.SIK1在糖尿病腎病大鼠腎臟的表達(dá)和意義
　　(1)

10、wistar大鼠腹腔注射STZ成功建立1型糖尿病模型。與正常對(duì)照組比較,模型組表現(xiàn)出多飲、多食及體重減輕的特點(diǎn)。20周齡時(shí),模型組餐后血糖水平升高,但血甘油三酯及膽固醇水平正常。與正常對(duì)照組相比,模型組出現(xiàn)糖尿病腎病的明顯特征,各腎功能指標(biāo)均表現(xiàn)出顯著性差異。糖尿病模型組24h尿量、腎體重比、尿白蛋白分泌率、血肌酐,肌酐清除率,血尿素氮指標(biāo)水平均明顯升高,并出現(xiàn)腎小球肥大、纖維化,基底膜增厚等病理改變,腎小球面積及系膜增殖指數(shù)明顯增大。

11、
　　(2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SIK1在正常大鼠腎臟的腎小球及遠(yuǎn)曲小管表達(dá)明顯,在近曲小管表達(dá)較少,且在各細(xì)胞的胞漿無著色,胞核無著色。在糖尿病模型組大鼠中,SIK1在腎小管的表達(dá)與正常對(duì)照組一致。而在腎小球的隨病程月數(shù)的增加,SIK1的表達(dá)依次減少,呈時(shí)間依賴性。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在糖尿病大鼠腎組織SIK1的表達(dá)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯變化,與正常對(duì)照組大鼠20周齡一致。而腎組織SIK1磷酸化水平在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)卻依次減

12、少,且均明顯低于正常對(duì)照組大鼠20周齡腎組織SIK1磷酸化水平。分離腎小球提取蛋白發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠腎小球SIK1的表達(dá)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)卻依次減少,均明顯低于正常對(duì)照組大鼠20周齡腎小球SIK1的表達(dá)。
　　(3)與正常對(duì)照組大鼠相比,Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)20周齡糖尿病大鼠腎小球ALK5、FN、PAI-1表達(dá)明顯增高,Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎小球腎小球膠原纖維及ECM明顯聚集。
　　2.高糖刺激對(duì)系膜細(xì)胞

13、SIK1的表達(dá)、活性、細(xì)胞內(nèi)分布及ALK5信號(hào)通路的影響,SIK1表達(dá)質(zhì)粒對(duì)高糖刺激下的系膜細(xì)胞ALK5信號(hào)通路及系膜細(xì)胞增殖的影響
　　(1)高糖刺激后0、12、24、48h,經(jīng)免疫沉淀及Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SIK1的表達(dá)及磷酸化水平依次遞減,呈時(shí)間依賴性,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞免疫熒光后激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)SIK1在HBZY-1細(xì)胞的核內(nèi)外均勻表達(dá),高糖刺激下表達(dá)減少并向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)染pEGFP-SIK1表達(dá)質(zhì)粒后,激

14、光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)GFP熒光信號(hào)在高糖刺激下由核外向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　(2)高糖刺激后0、12、24、48h,經(jīng)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ALK5、FN、PAI-1表達(dá)水平依次遞增,呈時(shí)間依賴性,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相對(duì)于高糖刺激后0h,細(xì)胞免疫組化發(fā)現(xiàn)在高糖刺激48h后FN、PAI-1表達(dá)水平明顯增高。
　　(3)經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析,質(zhì)粒符合設(shè)計(jì)要求,命名為pCDF1-SIK1。轉(zhuǎn)染HBZY-1細(xì)胞24h后熒光倒置顯微鏡可見

15、綠色熒光蛋白表達(dá),48h表達(dá)量達(dá)60%以上。相對(duì)于正常對(duì)照組及pCDF1空質(zhì)粒對(duì)照組,半定量RT-PCR及Westernblot檢測(cè)提示pCDF1-SIK組mRNA水平分別增加1.81和1.86倍,蛋白水平分別增加1.81和2.06,繼續(xù)高糖刺激48h后,Westernblot檢測(cè)提示pCDF1-SIK組ALK5蛋白水平降低37.5%和39%,FN、PAI-1表達(dá)水平亦明顯下降,并且MTT檢測(cè)提示pCDF1-SIK可明顯抑制高糖對(duì)HBZ

16、Y-1細(xì)胞的增殖作用。
　　【結(jié)論】
　　(1)Wistar鼠腹腔注射STZ建立的1型糖尿病模型,在20周齡時(shí)出現(xiàn)糖尿病腎病的明顯特征有,明顯的ECM聚集;(2)SIK1主要在正常大鼠腎臟的遠(yuǎn)曲小管和腎小球表達(dá)明顯,在近曲小管表達(dá)較少。隨著糖尿病病程進(jìn)展,腎臟SIK1表達(dá)無明顯變化,但腎臟SIK1磷酸化水平及腎小球SIK1的表達(dá)逐漸減少。而在20周齡時(shí)腎小球ALK5,FN及PAI-1表達(dá)明顯,提示SIK1在腎小球表達(dá)減少可能

17、參與腎小球纖維化早期病變的發(fā)生和發(fā)展;(3)在細(xì)胞模型上,高糖可抑制SIK1的182位點(diǎn)磷酸化水平及表達(dá)水平,導(dǎo)致SIK1向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)高糖激活A(yù)LK5信號(hào)通路,提示SIK1的182位點(diǎn)磷酸化的抑制是高糖下調(diào)SIK1的主要原因,受抑制的SIK1可能導(dǎo)致ALK5信號(hào)通路的激活,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ECM聚集和細(xì)胞增殖。(4)重組質(zhì)粒pCDF1-SIK能夠激活體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞SIK1蛋白表達(dá),下調(diào)ALK5信號(hào)通路,減少細(xì)胞內(nèi)ECM聚