中華眼鏡蛇毒金屬蛋白酶MT和烙鐵頭蛇毒TM-N49誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞釋放組胺的研究.pdf

1、背景與目的:
　　肥大細(xì)胞激活后脫顆粒釋放類(lèi)胰蛋白酶、類(lèi)糜蛋白酶、肝素、組胺及其它化學(xué)介質(zhì)成分,參與許多慢性炎癥反應(yīng)如應(yīng)激誘發(fā)的腸道潰瘍、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、間質(zhì)性膀胱炎、硬皮病及克隆氏病等,尤其是在變態(tài)反應(yīng)性疾病中起著至關(guān)重要的作用。變態(tài)反應(yīng)性炎癥包括支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性皮炎、食物及藥物過(guò)敏等,發(fā)病率約占全球人口的30％-40%,并有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。由于變態(tài)反應(yīng)性炎癥對(duì)人類(lèi)的危害極大,所以于2000年末被世界衛(wèi)生組織定為三大

2、非傳染性疾病項(xiàng)目之一。近年,越來(lái)越多的證據(jù)證明肥大細(xì)胞激活后釋放的主要介質(zhì)可能是引起變態(tài)反應(yīng)性炎癥發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制。肥大細(xì)胞的這種脫顆粒反應(yīng),既是機(jī)體的一種防御反應(yīng),也是速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和炎癥等病理反應(yīng)的基礎(chǔ),圍繞穩(wěn)定肥大細(xì)胞而產(chǎn)生的療法將會(huì)成為今后一段時(shí)間內(nèi)治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的主流。探討肥大細(xì)胞激活途徑及其機(jī)制能給治療變態(tài)反應(yīng)性炎癥及其它與肥大細(xì)胞相關(guān)的疾病的治療提供新思路。
　　目前對(duì)于肥大細(xì)胞的IgE依賴(lài)性激活途徑的研究已進(jìn)行得

3、很深入,其機(jī)制已開(kāi)始明朗;但非IgE依賴(lài)性激活途徑的確切作用機(jī)制還不甚明了。本研究所在“長(zhǎng)江學(xué)者”何教授帶領(lǐng)下經(jīng)過(guò)多年努力,提出了肥大細(xì)胞自身放大機(jī)制的假說(shuō),并逐漸完善,這是對(duì)肥大細(xì)胞激活機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)。
　　人被毒蛇咬傷后局部可見(jiàn)明顯組織壞死和炎癥,早期蛇毒與肥大細(xì)胞之間的作用在動(dòng)物上研究過(guò),發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒等能誘導(dǎo)大鼠橫隔膜、腹膜和幾尼豬肺部肥大細(xì)胞釋放組胺,其激活肥大細(xì)胞的方式是非IgE依賴(lài)性的,但蛇毒對(duì)人肥大細(xì)胞的作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)

4、報(bào)道。我們用純化的蛇毒MT、TM-N49與人肺、大腸及扁桃體組織肥大細(xì)胞共同孵育,觀(guān)察其對(duì)人肥大細(xì)胞釋放組胺的誘導(dǎo)作用,探討人肥大細(xì)胞非 IgE依賴(lài)性激活的作用機(jī)制,給變態(tài)反應(yīng)性炎癥及其它相關(guān)疾病的治療提供參考資料。
　　方法:
　　將粗中華眼鏡蛇毒粉溶于緩沖液中,上肝素凝膠柱和Superdex75親和力凝膠柱純化MT;將粗烙鐵頭蛇毒粉溶于緩沖液中,上SP-Sephadex C-25柱,肝素凝膠柱, Superdex75分子

5、篩及HPLC純化TM-N49。將手術(shù)切除的人肺、大腸和扁桃體組織在無(wú)菌條件下細(xì)細(xì)剪碎,在37℃條件下用Ⅰ型膠原酶和Ⅰ型透明質(zhì)酸酶消化,用100μm的濾網(wǎng)過(guò)濾,經(jīng)懸浮后的細(xì)胞均勻地加入含MT、TM-N49、刺激劑或緩沖液的試管中,在37℃條件下進(jìn)行激發(fā)實(shí)驗(yàn),激發(fā)管在4℃離心機(jī)中2000 rpm離心10 min后,收集細(xì)胞激發(fā)上清,用熒光顯色法測(cè)量上清液的組胺水平。
　　結(jié)果:
　　純化后的MT在SDS-PAGE上呈1條帶。MT

6、能誘導(dǎo)人肺、大腸和扁桃體肥大細(xì)胞發(fā)生劑量依賴(lài)性組胺釋放,其誘導(dǎo)方式為非 IgE依賴(lài)性。濃度低至0.03μg/ml時(shí), MT就能誘導(dǎo)大腸肥大細(xì)胞顯著性的組胺釋放,但對(duì)于肺和扁桃體的肥大細(xì)胞, MT的最低有效濃度分別為0.3μg/ml和30μg/ml。 MT誘導(dǎo)大腸和肺肥大細(xì)胞組胺釋放,12 min時(shí)達(dá)高峰,而扁桃體肥大細(xì)胞的組胺釋放則在8 min時(shí)達(dá)高峰。人大腸、肺和扁桃體肥大細(xì)胞經(jīng)代謝抑制劑和百日咳毒素預(yù)處理后,MT誘導(dǎo)其釋放組胺的作用

7、明顯減弱。缺乏外源性鈣、鎂離子時(shí),MT誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺的能力也明顯減弱。
　　純化后的TM-N49在SDS-PAGE上呈一條帶。TM-N49能誘導(dǎo)人肺、大腸和扁桃體肥大細(xì)胞發(fā)生劑量依賴(lài)性組胺釋放。濃度為0.3μg/ml時(shí), TM-N49就能誘導(dǎo)大腸肥大細(xì)胞顯著性的組胺釋放,但對(duì)于人肺肥大細(xì)胞來(lái)說(shuō),誘導(dǎo)它釋放相同量組胺所需最低TM-N49濃度為3μg/ml,而對(duì)于扁桃體肥大細(xì)胞,TM-N49濃度為30μg/ml時(shí)才能誘導(dǎo)它顯著性

8、的組胺釋。TM-N49誘導(dǎo)大腸和肺肥大細(xì)胞組胺的釋放10 min和8 min時(shí)達(dá)高峰,而扁桃體肥大細(xì)胞的組胺釋放則在16 min時(shí)達(dá)高峰。人大腸、肺和扁桃體肥大細(xì)胞經(jīng)代謝抑制劑和百日咳毒素預(yù)先處理后,濃度低于30μg/ml的TM-N49誘導(dǎo)其釋放組胺的作用明顯減弱,但當(dāng)其濃度達(dá)到30μg/ml時(shí),上述處理對(duì)TM-N49誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞釋放組胺的作用無(wú)影響。缺乏外源性鈣、鎂離子時(shí),TM-N49誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺的能力也明顯減弱。