五步蛇毒腺基因表達譜的構(gòu)建及金屬蛋白酶Agkihagin的克隆與表達.pdf

1、研究目的：以EST分析方法構(gòu)建五步蛇毒腺基因表達譜，發(fā)現(xiàn)和鑒定凝血紊亂和出血癥狀毒素相關(guān)基因，為開發(fā)蛇毒基因工程藥物提供序列資源。 研究方法： 1.以TRIZOL試劑提取新鮮五步蛇毒腺總RNA，以superscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈并以DNA多聚酶Ⅰ連續(xù)合成第二鏈。雙鏈DNA經(jīng)過含EcoRⅠ酶切位點接頭加接，末端磷酸化并以XhoⅠ內(nèi)切酶酶切，按照＜0.25kb，0.25～0.5kb，0.5～1kb，1～2k

2、b和＞2kb5個片斷大小分別回收，隨后與pBluescriptⅡSK(+)載體相連轉(zhuǎn)化E.coliDH10B，構(gòu)建成五步蛇毒腺cDNA文庫。 2.各個片斷的cDNA文庫中隨機挑取克隆，以96孔板培養(yǎng)于含有100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，過夜搖菌培養(yǎng)16h.堿裂解法提取DNA，利用MegaBACE1000自動測序儀從克隆5’端以T3通用引物進行單向測序。 原始峰圖的堿基識別與質(zhì)量評估由Phred軟件(Phred-P

3、hrap-Consedpackage)完成，堿基質(zhì)量參數(shù)的域值設(shè)為Q20(99％準確度)，去除低質(zhì)量序列。在利用CROSSMATCH程序屏蔽載體序列，進一步剔除接頭序列，得到原始的EST序列。為了獲取毒腺分泌性多肽的序列信息，保留長度小于50bp的EST序列用于后繼分析。 利用拼接程序Phrap對所有高質(zhì)量ESTs進行拼接，除了最小重疊區(qū)為40bp及一致性為99％，其余的參數(shù)均為默認值。隨機挑取克隆5’末端測序，共獲得8696條

4、高質(zhì)量表達序列標簽(ESTs)，經(jīng)過序列拼接和聚類，這些序列在經(jīng)過功能注釋后最終被聚類成2855個基因聚類。拼接后得到的克隆重疊群和單拷貝序列(稱為基因聚類)以Consed軟件手工檢查拼接質(zhì)量。所有基因聚類用BLASTX(Evalues＜10-5)和BLASTN(Evalues＜10-10)搜索GenBank的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫和核酸序列數(shù)據(jù)庫。序列注釋同時根據(jù)同源性最高的注釋和具體匹配序列情況而定。在非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫和核酸序列數(shù)據(jù)庫中無

5、同源性的一致性序列用以搜索dbEST數(shù)據(jù)庫和hmmpfam數(shù)據(jù)庫。根據(jù)標準基因詞匯體系(GeneOntology，GO)，我們把具有注釋信息的基因聚類進行了分類。以GO分子功能分類條目為標準，建立了毒腺基因表達譜。同時，將具有相應(yīng)酶號的基因聚類進行KEGG代謝途徑分析。 3.2855個基因聚類中，發(fā)現(xiàn)一個由74個克隆組成的基因聚類(Agkihagin)為新的金屬蛋白酶基因。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和巢氏PCR擴增該基因并對其進行結(jié)構(gòu)分析。在釀酒

6、酵母真核表達系統(tǒng)中表達Agkihagin及其改造突變體Agkihagin-Met和Agkihagin-Dis并純化。 結(jié)果： 1.構(gòu)建好的文庫含有2.048×106個重組子，克隆重組率為81.3％。 2.通過大規(guī)模隨機測序和生物信息學(xué)分析獲得了2855個基因聚類并確定了118個毒素基因和一系列毒腺細胞蛋白相關(guān)基因。重點確定了那些毒素相關(guān)基因，其產(chǎn)物是導(dǎo)致了五步蛇咬傷中出現(xiàn)的凝血紊亂和出血癥狀主要原因。 3

7、.克隆了新的Ⅲ型金屬蛋白酶基因Agkihagin，得到其全長。在酵母真核表達系統(tǒng)中成功表達和純化Agkihagin及其改造突變體。 結(jié)論： 1.該文庫符合建庫標準庫容要求，為構(gòu)建五步蛇毒腺基因表達譜和篩選新的目的基因提供了有效平臺。 2.我們獲取了迄今較為完整的五步蛇毒腺基因表達譜，該圖譜和一些功能未知的EST序列為蛇毒的比較研究和新的毒性成分的發(fā)現(xiàn)提供了重要資源。重點確定的那些毒素相關(guān)基因，為在分子水平上揭示五