流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)牛乳中大腸桿菌數(shù)及細(xì)菌總數(shù)的研究.pdf

1、目的：生乳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物繁殖速度快。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，給企業(yè)的正常生產(chǎn)帶來(lái)不便，甚至經(jīng)濟(jì)損失。所以要求一種能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出微生物的方法。本課題旨在研究利用流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)生乳中的細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌兩個(gè)微生物指標(biāo)。 方法：本研究首先建立生乳前處理方法用來(lái)排除生乳中大顆粒物質(zhì)對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的干擾；利用PI對(duì)全部細(xì)菌進(jìn)行染色，利用熒光抗體ab30522對(duì)大腸桿菌進(jìn)行特異性染色，并對(duì)染色條件進(jìn)行摸索；在流式細(xì)胞

2、儀的EXP032 ADC操作系統(tǒng)上建立微生物的檢測(cè)程序；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌分別與平皿菌落計(jì)數(shù)法、MPN法進(jìn)行比較分析。 結(jié)果：研究結(jié)果如下： 1．生乳前處理方法：取一定量生乳用300目尼龍膜過濾：取200μl生乳置于EP管中，加蛋白酶K(20mg/ml)5μl、TritonX-100 1μl，50℃消化15min；加800μl 0.1M PBS(pH=7.2)；100℃沸水浴5min 14000g離心5

3、min(或10min)，微量進(jìn)樣器小心移去脂肪層和上清，保留沉淀(沉淀即細(xì)菌)。 注：當(dāng)檢測(cè)乳中總菌數(shù)時(shí)熱處理的參數(shù)為100℃沸水浴5min；當(dāng)檢測(cè)乳中大腸桿菌時(shí)熱處理的參數(shù)為100℃沸水浴10min。 2．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)流程：生乳前處理；加190μl的0.1MPBS(pH=7.2)重懸沉淀；加PI染液(20μg/ml)10μl，避光染色5min;將樣品移入流式管中，0.1MPBS適當(dāng)稀釋；利用EXP

4、O32 ADC操作系統(tǒng)進(jìn)行分析。 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中大腸桿菌的檢測(cè)流程：生乳前處理；用稀釋倍數(shù)為100倍的熒光抗體ab30522 100μl染色20min，0.1M PBS適當(dāng)稀釋。利用EXP032 ADC操作系統(tǒng)進(jìn)行分析。 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)時(shí)間為40min;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中大腸桿菌的檢測(cè)時(shí)間為60min。 5．流式細(xì)胞術(shù)的最低檢測(cè)限為單位體積1個(gè)細(xì)胞；樣品中細(xì)菌濃度的檢測(cè)上限是2

5、.4×10<'7>/ml，檢測(cè)結(jié)果接近2.4×10<'7>/ml的樣品應(yīng)該適當(dāng)稀釋再進(jìn)行檢測(cè)。 6．將流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中細(xì)菌總數(shù)與平皿菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩者呈正的直線相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)程度為顯著相關(guān)(r=0.9360)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中大腸桿菌和MPN法檢測(cè)結(jié)果的對(duì)數(shù)值具有顯著的相關(guān)性(r=0.96，P<0.01，)，兩者擬合的回歸方程為y=1.2443x-1.4718。 結(jié)論：流式細(xì)胞術(shù)能夠極大