應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平敏感性實(shí)驗(yàn)條件的初步研究.pdf

1、目的：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確、快速檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法的建立,有賴于實(shí)驗(yàn)過程中生物安全、細(xì)菌顆粒易于導(dǎo)致儀器管道堵塞等基礎(chǔ)性問題的解決,同時(shí)針對復(fù)雜的影響因素對藥物敏感性測定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索也是方法得以良好建立的必須過程。本研究將著力進(jìn)行這些工作。
　　方法：1.在應(yīng)用流細(xì)胞術(shù)檢測前滅活受檢細(xì)菌,確保實(shí)驗(yàn)生物安全:以不影響檢測結(jié)果為前提,采用高溫(65℃-85℃,水浴30分鐘)與多聚甲醛溶液(終濃度為0.5％-1%,1

2、0-60分鐘)兩種方法處理結(jié)核分枝桿菌,并對其進(jìn)行接種與培養(yǎng),觀察結(jié)核分枝桿菌在不同高溫、不同多聚甲醛濃度作用不同時(shí)間后的生長情況。2.應(yīng)用細(xì)胞篩網(wǎng)濾過“團(tuán)塊”細(xì)菌,解決檢測中可能出現(xiàn)的儀器管道堵塞問題:綜合考慮流式細(xì)胞儀噴嘴孔徑大小、結(jié)核分枝桿菌聚集生長習(xí)性和專業(yè)人員技術(shù)指導(dǎo)意見等多方面因素,并咨詢流式細(xì)胞技術(shù)專家,分析比較200目和300目細(xì)胞篩網(wǎng)方法制備菌懸液的效果。3.通過測定結(jié)核分枝桿菌對利福平(RFP)的敏感性來摸索最佳的實(shí)

3、驗(yàn)條件:(1)實(shí)驗(yàn)分析醋酸熒光素(FDA)染料鑒別結(jié)核分枝桿菌死活狀態(tài)的性能,考察在藥物敏感性測定中FDA區(qū)分失活敏感株和維持活力耐藥株的能力;(2)遵循正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用單因素方差分析和Friedman秩和檢驗(yàn)分析FDA濃度(250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml)、藥物濃度(0.75μg/ml、1μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/m

4、l)及其與細(xì)菌作用時(shí)間(24h、48h和72h)對檢測熒光強(qiáng)度的影響,初步確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。
　　結(jié)果：1.65℃、70℃和85℃水浴30分鐘與0.5%和1%多聚甲醛溶液分別固定10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘后的結(jié)核菌株在7H10瓊脂培養(yǎng)基上未見菌落生長,結(jié)果表明,這兩種方法均可快速殺滅結(jié)核分枝桿菌,其殺滅結(jié)核分枝桿菌的效能均為100%(20例不生長/20例菌株)。2.肉眼觀察到300目細(xì)胞篩網(wǎng)制備的菌懸液顆粒較200目的

5、更均勻而細(xì)膩,且300目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后的17例菌懸液均具備良好的生長活力,在上機(jī)檢測時(shí)未出現(xiàn)儀器堵管情況。3.(1)活菌和死菌分別與FDA作用后,活菌管在FDA三個(gè)濃度(250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml)的熒光強(qiáng)度分別為1.6、2.6和4.8,而死菌管的分別為1、1.8和3.4,敏感指數(shù)(死菌管的熒光強(qiáng)度/活菌管的熒光強(qiáng)度)波動(dòng)在0.625-0.708,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,活菌管的熒光強(qiáng)度高于死菌管,且兩者間的敏感指數(shù)不

6、隨FDA濃度的變化而變化。(2)在17例不同結(jié)核菌株的研究中,FDA、藥物作用時(shí)間和利福平3個(gè)因素對敏感指數(shù)影響有顯著差異的例數(shù)分別有7例、14例和8例,其中,分別有3例、12例和0例對敏感指數(shù)的影響最大;在同一區(qū)組(菌株)內(nèi),藥物作用時(shí)間3個(gè)水平和利福平9個(gè)濃度水平對敏感指數(shù)均有顯著的影響,其影響大小依次為:48h>24h>72h(T2>T1>T3),80μg/ml>10μg/ml>1.25μg/ml>40μg/ml>5μg/ml>1

7、μg/ml>2.5μg/ml>20μg/ml>0.75μg/ml(R9>R6>R3>R8>R5>R2>R4>R7>R1),而FDA的3個(gè)濃度水平對敏感指數(shù)的影響無差異。另外,在17例的流式細(xì)胞術(shù)藥敏結(jié)果中,有8例利福平敏感菌株的敏感指數(shù)在利福平作用后變化不大或有上升的傾向,與文獻(xiàn)報(bào)道的判斷標(biāo)準(zhǔn)不相符。
　　結(jié)論：高溫和多聚甲醛兩種方法均能快速殺滅結(jié)核分枝桿菌,可解決流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中所面臨的生物安全問題;應(yīng)