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1、副結(jié)核病(paratuberculosis)又稱Johne's病,是由分枝桿菌屬副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium avium ssp.paratuberculosis,MAP)引起的一種以反芻動物為主的慢性、消耗性傳染病。目前,該病在世界廣泛流行,以奶牛業(yè)和肉牛業(yè)發(fā)達的國家危害嚴(yán)重,現(xiàn)已成為飼養(yǎng)業(yè)嚴(yán)重流行的傳染病之一。另外,國外從人的Crohn's病患者體內(nèi)分離出MAP。因此,Johne's病已引起了全世界的廣泛關(guān)注。
2、 目前,該病尚無有效的治療藥物,因此該病的預(yù)防主要采取檢出、隔離或淘汰,即以副結(jié)核PPD進行檢疫,對檢出的陽性牛進行隔離與淘汰。此外,國內(nèi)外也有采用預(yù)防接種的方法來控制該病,即將MAP熱滅活或致弱后制成疫苗,免疫接種牛和羊,可降低該病的發(fā)生率。但是疫苗接種后會使動物血清轉(zhuǎn)為陽性,干擾變態(tài)反應(yīng)和血清學(xué)檢測,以及對結(jié)核菌素敏感,妨礙牛結(jié)核病和副結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)檢測。因此,有待開發(fā)新型的預(yù)防疫苗和診斷試劑,以促進畜牧業(yè)的健康發(fā)展。 研
3、究發(fā)現(xiàn),副結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在的大量分泌蛋白能有效地誘發(fā)對副結(jié)核分枝桿菌的抵抗性,產(chǎn)生免疫保護作用。其中,SOD是副結(jié)核分枝桿菌的一種主要分泌蛋白。DNA疫苗能有效地刺激機體產(chǎn)生持久的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,其中,激活CTL及殺滅靶細(xì)胞是DNA疫苗發(fā)揮保護作用的最主要機制之一,而且不干擾變態(tài)反應(yīng)檢測,這正是抗副結(jié)核感染所必需的。 為了研制牛副結(jié)核病新型的預(yù)防制劑,尤其是DNA疫苗,本研究將重組質(zhì)粒pGEM-T-SOD中的S
4、OD基因亞克隆至真核表達載體pVAX1中,成功地構(gòu)建出真核表達重組質(zhì)粒pVAX1-SOD。以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pVAX1-SOD轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中,通過熒光抗體技術(shù)和RT-PCR方法證實SOD基因在哺乳動物細(xì)胞中獲得了表達。 以pVAX1-SOD分別對BALB/c小鼠和豚鼠進行了免疫,同時設(shè)pVAX1、生理鹽水、副結(jié)核分枝桿菌超聲抗原對照組。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果表明,pVAX1-SOD免疫組與對照組間沒有顯著差異(P>0.05
5、)。小鼠脾臟CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,pVAX1-SOD免疫組的CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量與生理鹽水、pVAX1對照組間沒有差異,而CD3+T細(xì)胞數(shù)量則存在差異,但沒有達到統(tǒng)計學(xué)上的顯著水平(P>0.05)。pVAX1-SOD免疫小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清的IFN-γ含量顯著地高于生理鹽水、pVAX1對照組(P<0.05)。間接ELISA檢測結(jié)果表明,免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對SOD抗原的特異性抗體。豚鼠變態(tài)反應(yīng)結(jié)果顯
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