利用流式細胞術(shù)研究小鼠子宮NK細胞的表型特征.pdf

1、在正常懷孕時，母體免疫系統(tǒng)進入一種特定的狀態(tài)。胎兒作為“半同種移植物”卻不被母體排斥的現(xiàn)象似乎與經(jīng)典的移植免疫的理論相矛盾。通過對人類子宮內(nèi)膜植入位點周圍淋巴細胞的研究，人們發(fā)現(xiàn)人類NK(CD56brightCD16dim)細胞在其中占有絕對多數(shù)，其比率達到70％以上，該群細胞又被稱為uNK細胞。利用組織學的方法也可觀察到孕鼠子宮植入位點周圍蛻膜區(qū)中，uNK細胞占到30％。盡管它們有著潛在細胞毒作用，但在正常妊娠時，并沒有殺傷這些滋養(yǎng)層

2、細胞，其中的機制至今未明，推測uNK細胞對母胎免疫起負調(diào)節(jié)作用，在維持母胎免疫耐受中起重要作用。因此，分離和鑒定uNK細胞對于發(fā)現(xiàn)NK細胞的特有亞群及其功能以及相關免疫性疾病有十分重要意義。小鼠是開展免疫學研究的主要動物模型，建立有效的小鼠子宮蛻膜淋巴細胞分離及鑒定方法是研究uNK細胞的關鍵。 由于分離和培養(yǎng)小鼠uNK細胞的難度較大，過去對于此群細胞的研究多是采用組織形態(tài)學的方法(如免疫組化方法)，該方法受到抗體靈敏度的限制，實

3、驗周期較長，各實驗室之間難于統(tǒng)一標準，假陽性和假陰性的可能性較大。該實驗擬在國際上首次用機械法和酶消化法分離小鼠子宮淋巴細胞并利用流式細胞術(shù)對小鼠子宮uNK細胞的表型進行鑒定。流式細胞儀能夠快速的、定量的、多參數(shù)的分析單個活(或死)的細胞，并能進行細胞亞群的分析。這將有助于了解母胎界面的免疫微環(huán)境，為探討母胎免疫耐受機制，尤其是高比例uNK細胞所發(fā)揮的免疫學作用奠定重要的實驗基礎。 主要研究內(nèi)容及方法: 1.分離小鼠子宮

4、蛻膜淋巴細胞方法的建立 成功的建立了機械法和胰酶消化法分離小鼠子宮蛻膜淋巴細胞的方法。酶消化法細胞得率是機械法的兩倍。通常，機械法1只12～14周齡的懷孕中期(gd=10)的懷有9～10胎的孕鼠中可以分離得到0.5～1×106個細胞；酶消化法可以分離得到1～2×106個細胞。進一步分析三類淋巴細胞：T，NK，NKT細胞亞群的比例受分離方法的影響，發(fā)現(xiàn)酶消化法并未降低DX5+NK細胞的比例，子宮中T淋巴細胞及NKT細胞的比例在機械

5、法與消化法之間也沒有區(qū)別。即：T，NK，NKT三類淋巴細胞的相對比例在機械法與消化法之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。然而酶消化使小鼠uNK細胞的CD69表達明顯上調(diào)。鑒于此，研究者用機械法分離得到小鼠子宮淋巴細胞進行流式細胞術(shù)檢測，以得到其表型的穩(wěn)定結(jié)果。 2.流式細胞術(shù)對小鼠子宮內(nèi)膜淋巴細胞亞群的鑒定 在懷孕第10天(gd10)的C57BL/6J小鼠子宮蛻膜中，uNK細胞(NK1.1+CD3-)構(gòu)成最主要的淋巴細胞亞群，占總淋

6、巴細胞數(shù)比例的48.74％，且處女鼠中子宮內(nèi)膜NK細胞的比例明顯低于孕鼠，約為35.66％。T細胞(CD3+NK1.1-)構(gòu)成了小鼠子宮內(nèi)膜淋巴細胞的第二大亞群，占總淋巴細胞數(shù)比例的30.06％，并且CD4+T/CD8+T的比值為2，孕鼠與處女鼠之間無顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn)NKT細胞的比例在懷孕后也有一個明顯的增長，其比例為4.2％。CD19+B細胞在子宮內(nèi)膜的存在微乎其微，但與子宮內(nèi)膜結(jié)合的胎盤中，B淋巴細胞為主要的淋巴細胞。

7、3.流式細胞術(shù)分析小鼠子宮蛻膜淋巴細胞各亞群比例的動力學變化 子宮內(nèi)膜uNK細胞比例隨著懷孕天數(shù)的增長，經(jīng)歷著一個動力學的變化過程。受精卵的植入一般發(fā)生在懷孕第4天。在C57BL/6J小鼠，當檢測懷孕6天(gd6)小鼠的子宮蛻膜淋巴細胞時，其數(shù)目比處女鼠有了明顯增長，uNK細胞大量出現(xiàn)(26.21±4.76％)，之后隨著懷孕天數(shù)的增長，uNK細胞迅速增殖，在懷孕的第10天(gd10)，NK細胞的比例達到最高峰(43.07±12.

8、93％)，之后uNK細胞減少，到懷孕的第12天(gd12)，uNK細胞比例下降明顯(38.57±0.98％)。到懷孕第14天時(gd14)時，uNK細胞比例已下降到較低水平，到懷孕末期uNK細胞幾乎消失。與此同時，NKT細胞的比例也經(jīng)歷著相似的動力學變化過程,NKT細胞的比例在小鼠懷孕第10天(gd10)達到最高峰。BALB/C小鼠子宮uNK細胞比例經(jīng)歷著與C57BL/6J小鼠相似的變化過程。為了驗證流式結(jié)果的正確性，研究者對懷孕十天和

9、十二天的小鼠子宮進行了固定，包埋并做組織學PAS染色。結(jié)果證明，uNK細胞的數(shù)量在正常懷孕老鼠于第10天達到最高峰，從懷孕第12天uNK細胞數(shù)量開始迅速下降。 4.流式細胞術(shù)分析小鼠子宮uNK細胞的表型 研究者利用流式細胞術(shù)分析和比較了NK細胞活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A在uNK細胞上的表達。幾乎所有小鼠子宮uNK細胞均高表達NKG2D，而且NKG2D的表達水平在子宮和其他外周臟器(脾臟，肝臟，外周血)之間

10、沒有顯著性差異。在C57BL/6J和BALB/C鼠中，均約有一半的小鼠uNK細胞為NKG2A/C/E+。其陽性比率在子宮和其他外周臟器(脾臟，肝臟，外周血)之間沒有顯著性差異。又進一步檢測了NKG2A在C57BL/6J鼠uNK細胞的表達，平均35.22±2.2％小鼠uNK細胞表達NKG2A，而55.60±2.60％肝臟NK細胞表達NKG2A。uNK細胞表達NKG2A的水平比肝臟NK低，這與人的報道相反。約58％的子宮uNK細胞表達CD9

11、4。這在一定程度上與NKG2A/C/E的表達相對應。對于NKG2D，NKG2A/C/E，NKG2A，CD94的表達水平，隨著懷孕天數(shù)的增長，表達水平?jīng)]有顯著性差異。孕鼠與處女鼠之間也沒有顯著性差異。 5.流式細胞術(shù)分析小鼠子宮uNK細胞亞群uNK細胞包括NK1.1+DX5+細胞，和NK1.1+DX5-細胞，其中前者占絕對多數(shù)，uNK細胞高表達CD122，uNK細胞的在發(fā)育上屬于成熟的NK細胞亞群。 結(jié)論: 1.小

12、鼠子宮蛻膜淋巴細胞可以用機械法或酶消化法分離得到。機械法相對穩(wěn)定，結(jié)果平行性好； 2.鼠子宮蛻膜淋巴細胞主要有NK，T和NKT等細胞亞群，懷孕中期NK細胞占絕對多數(shù)； 3.小鼠子宮中存在大量的uNK細胞。小鼠懷孕早期和中期，uNK細胞占子宮淋巴細胞的比例隨著懷孕天數(shù)的增長而增長，到懷孕的第10天達到高峰，第12天之后開始迅速下降； 4.小鼠uNK細胞均表達NKG2D，約35.22±2.20％的uNK細胞表達NKG