流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用描述

1、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用何 玉 萍,科研型 分選功能488nm激光 四色熒光(525、575、610、675nm）,,一、流式細(xì)胞術(shù)的原理,流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于細(xì)胞計(jì)數(shù)自動化的研究。其原理是被熒光染色的單細(xì)胞或顆粒，經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì)胞依次通過流動室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號，這些熒光信號可以反映細(xì)胞的生物特性。,,前向散射,激光,FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細(xì)胞流）,

2、樣本管,,鞘液管,,近30年來流式細(xì)胞術(shù)在我國得到很快的發(fā)展，應(yīng)用范圍不斷增大。目前，流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。,二、流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn),速度快　　極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測上萬個細(xì)胞，甚至幾萬個細(xì)胞。多參數(shù)分析　　可同時分析單個細(xì)胞的多種特性，獲得單個細(xì)胞多種信息，也可以根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志的不同把細(xì)胞群分為各亞

3、群。,定性、定量分析細(xì)胞　　通過熒光染色對單細(xì)胞的某些成分，如：DNA、抗原或受體等進(jìn)行定性、定量分析。 靈敏度高 　　熒光能檢測到單個微粒上標(biāo)有熒光分子少于<600個 (如FITC或PE)；前向角檢測到小于0.3um顆粒。 分選感興趣的細(xì)胞 純度達(dá)99%，收獲率可達(dá)90%。,流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍細(xì)胞大小細(xì)胞表面分子:CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測:細(xì)胞周期、細(xì)胞

4、凋亡其他：線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,常用熒光素,三、單克隆抗體標(biāo)記熒光探針選擇1.了解激發(fā)光波長和發(fā)射波長,,2. 要有高的光子產(chǎn)量---提高信號強(qiáng)度。3. 對激光有強(qiáng)的吸收----降低背景噪音。4. 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間差距大---減少 干擾。5. 易與被標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合，而不影響被標(biāo)記 物的特異性。6. 穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標(biāo)本抗凝劑 和固定劑等影響。,常用熒光探針組合,細(xì)胞表型分

5、析： 雙色分析：FITC與PE 三色分析：雙色分析+PE-CY5 四色分析：三色分析+ECDDNA含量分析： PI 凋亡與壞死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI雙染,四、標(biāo)本的收集、單細(xì)胞懸液的制備 骨髓、外周血、細(xì)胞株、組織器官、 胸水、腹水、尿液脫落細(xì)胞等,1、骨髓及外周血細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 骨髓及外周血都是天然的單個細(xì)胞，可直接標(biāo)記，

6、再溶血。,,單細(xì)胞的分離制備 分離液 血液+生理鹽水 離心 2500r/min，20-30min 單個核細(xì)胞,,,,,,單核細(xì)胞: 利用單核細(xì)胞在短時培養(yǎng)貼壁快的特性（30-40min），可采用短時培養(yǎng)獲得較純的單核細(xì)胞.,2、培養(yǎng)細(xì)胞樣品的制備(貼壁細(xì)胞) 培養(yǎng)板 吸去培養(yǎng)液 PBS洗2次 胰蛋白酶 37℃，室溫，3-5min 含血清的培養(yǎng)基

7、吹打 PBS洗2次 單細(xì)胞懸液。,,,,,,,,3. 組織器官單細(xì)胞懸液的制備 酶消化法 組織器官 單細(xì)胞制備儀 剪碎法

8、 機(jī)械法 網(wǎng)搓法 研磨法,,,,,,,（1）、酶消化法組織塊洗去血液 剪成小塊 胰蛋白酶 37℃，15-30min 含血清的培養(yǎng)基 100目鋼篩網(wǎng)過濾 300目尼龍網(wǎng)過濾 離心 1000r/min，5min PBS 洗2次 單細(xì)胞懸液。,,,,,,,,,（

9、2）、機(jī)械法 單細(xì)胞制備儀 組織塊洗去血液 剪成小塊 制備儀 2-3min 100目鋼篩網(wǎng)過濾 300目尼龍網(wǎng)過濾 離心 1000r/min，5min PBS 洗2次 單細(xì)胞懸液。 剪碎法 組織塊洗去血液 剪至漿狀 吸管輕輕吹打 100目鋼篩網(wǎng)過濾 300目尼龍網(wǎng)過濾 離心 1000r/min，5min

10、PBS 洗2次 單細(xì)胞懸液。,,,,,,,,,,,,,,,網(wǎng)搓法 組織塊洗去血液 100目鋼篩網(wǎng)輕搓 生理鹽水 收集濾液 300目尼龍網(wǎng)過濾 離心 1000r/min，5min PBS 洗2次 單細(xì)胞懸液。 研磨法 組織塊洗去血液 研磨器研至勻漿 100目鋼篩網(wǎng) 300目尼龍網(wǎng)過濾 離心 1000r/min，5min PBS洗

11、2次 單細(xì)胞懸液。,,,,,,,,,,,,,4. 石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備,醇乙脫水：70％→80%→90％→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石蠟包埋脫蠟水化：二甲苯脫蠟→ 100％醇乙→90%→80%→70％→50％→蒸餾水,手術(shù)獲得的新鮮實(shí)體組織，常要送病理石蠟包埋處理，這些標(biāo)本也可用于流式細(xì)胞術(shù)的檢測。,石蠟包埋組織制備 單細(xì)胞懸液 石蠟包埋組織切片 二甲苯脫蠟

12、1-2天 水化 乙醇，蒸餾水 組織器官 胰蛋白酶 37℃，15-30min 冰PBS 100目鋼篩網(wǎng)過濾 300目尼龍網(wǎng)過濾 離心 1000r/min，5min PBS 洗2次 單細(xì)胞懸液,,,,,,,,,,5. 脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備包括： 尿液脫落細(xì)胞 胸水、腹水脫落細(xì)胞 沖洗液脫落細(xì)胞,收集胸水、腹水、尿液、沖洗液 置 4℃ 冰箱中 沉淀 取底部10-

13、20ml PBS洗 3 次 300目尼龍濾網(wǎng)過濾 單細(xì)胞懸液收集方法、沉淀時間胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝 素液，置于4℃ 冰箱中靜置 6-12h尿 液：收集24h 尿液，置4℃冰箱中自然沉淀 2h沖洗液：300-500ml 生理鹽水沖洗膀胱 ，冰箱內(nèi)置 6-12h,,,,,,五、熒光標(biāo)記 主要包括間接免

14、疫熒光染色和直接免疫熒光染色兩種方法。 間接標(biāo)記是采用特異的無熒光標(biāo)記的一抗與待測標(biāo)本反應(yīng)后，洗去未結(jié)合抗體再加入熒光標(biāo)記的二抗，形成有熒光的抗原--抗體--抗體復(fù)合物。其操作復(fù)雜、費(fèi)時，目前很少用。在科研中需要一些新的抗體沒有直接抗體，只能采用此方法。 直接標(biāo)記是在標(biāo)記時加入連接著熒光素的特異性抗體，該方法簡單，目前廣泛應(yīng)用于各實(shí)驗(yàn)室。,羊抗兔兔抗小鼠 小鼠,直 標(biāo),間 標(biāo),

15、,,根據(jù)細(xì)胞部位的不同，可分為細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原染色，細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記需要固定、破膜等步驟 1.細(xì)胞表面抗原的標(biāo)記法（外周血為例 ） 全血50ul（5×105）+10ul相應(yīng)抗體→避光孵育15-30min → 溶血素→ 室溫10min → PBS洗1次 →上機(jī)分析（1% 多聚甲醛固定）。,2. 細(xì)胞漿或核內(nèi)抗原標(biāo)記法 收集單細(xì)胞懸(1×106)+固定劑A 室溫，15 min洗

16、滌去固定液 破膜劑B及抗體 室溫，15 min PBS洗滌1次 上機(jī)分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原同時標(biāo)記 在流式分析中通常需要細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)同時標(biāo)記，首先標(biāo)記表面抗原，然后再對細(xì)胞膜和核膜進(jìn)行固定破膜后再標(biāo)記胞內(nèi)或核內(nèi)抗原。 常見細(xì)胞破膜劑： 0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定

17、破膜劑（A、B）。,,,,,1、空白對照 用緩沖液（PBS）代替單克隆抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)2、陽性染色對照 用現(xiàn)有試劑和方法檢測已知表達(dá)某種特異性抗原的細(xì)胞即為陽性細(xì)胞。如檢測血小板CD62P時，可用被ADP誘導(dǎo)活化血小板作為CD62P檢測的陽性對照細(xì)胞。,六、熒光染色對照設(shè)置(空白對照 、陽性對照、陰性對照、 同型對照 ),3.陰性染色對照已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞即為陰性細(xì)胞群，如CD3/CD19雙染檢測健康人血液淋

18、巴細(xì)胞亞群時，應(yīng)有一群不表達(dá)這兩種抗原的雙陰性細(xì)胞群（主要是NK細(xì)胞），可作陰性對照。4. 同型對照 與染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型，如IgG-FITC、IgG-PE,七、熒光補(bǔ)償,流式細(xì)胞分析中常需要兩種或兩種以上不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行多色分析。由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射光譜性質(zhì)，發(fā)射光譜范圍有一定的重疊，出現(xiàn)結(jié)果誤差，克服這種誤差的有效方法就是使用熒光補(bǔ)償。,,,八、數(shù)據(jù)分析 流式

19、細(xì)胞術(shù)的目的是對我們感興趣的細(xì)胞進(jìn)行分析，其中設(shè)門技術(shù)是流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中最為獨(dú)特的技術(shù)，是指在細(xì)胞分布圖中指定一個范圍或一片區(qū)域（門），對其中的細(xì)胞進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。設(shè)門包括線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意門和四象門等。,,任意門、矩形門 　　 線性門 四象門,多重邏輯門：當(dāng)一種細(xì)胞有兩種以上的參數(shù)需要被分析時，常需要設(shè)多個門，各門之間由此出現(xiàn)邏輯關(guān)系，此種設(shè)門技術(shù)稱為多

20、重邏輯門或聯(lián)合門。,淋巴細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞（CD3+）,CD3+CD8-,IFN-r,IL-4,（CD4+）,數(shù)據(jù)顯示采用的圖:散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為單參數(shù)直方圖和雙參數(shù)散點(diǎn)圖。,,,參數(shù)的意義:FSC的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說，細(xì)胞越大，散射光越強(qiáng)，細(xì)胞越小,散射光越弱;SSC對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可反映細(xì)胞顆粒性程度大小。單參數(shù)直方圖X軸代表熒光或散射光的強(qiáng)度，Y軸代該道所具有相同

21、光信號細(xì)胞的頻率或相對的細(xì)胞數(shù)；雙參數(shù)散點(diǎn)圖X軸和Y軸均代表散射光或熒光的強(qiáng)度.,SSC,FSC,,九、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用及標(biāo)記方法,1、DNA含量分析 意義：腫瘤的早期診斷，腫瘤的良惡性判斷，觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及細(xì)胞周期分布。 正常生物細(xì)胞，DNA含量隨著細(xì)胞增殖周期時相而發(fā)生變化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期（4C）。,,,,2C,2C→4C,4C,,FCM進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析時，需要對

22、DNA進(jìn)行染色，DNA染料（PI）與DNA結(jié)合具有特異性，有一定量效關(guān)系，即DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度與DNA吸收熒光分子多少成正比。FCM分析一個 細(xì)胞群周期與DNA倍 體時，將DNA含量直 方圖分為三部分， 即G0/G1、S、G2/M 三個細(xì)胞峰。,G2/M(4C),G0/G1(2C),S(2C→4C),G2/M(4C),,方法： 細(xì)胞懸液（1*106） 70%冰乙醇 4&

23、#186;C ，24h 離心去固定液 PBS洗2次 RNase 30min PBS洗1次 PI 避光,30min 上機(jī)采集10000細(xì)胞，MultiCycle軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析,,,,,,,,G0/G1(2C),S(2C→4C),G2/M(4C),當(dāng)人體癌變或者具有惡性潛能的癌前病變時，在其發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨有細(xì)胞DNA倍體及S期的改變（異倍體） 惡性腫瘤細(xì)胞增殖周期的判斷： S>10、G2/

24、M>15或S>20、G2/M>5,2、 淋巴細(xì)胞亞群分析,白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的命名：　　　1982年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)合會，將所有抗體根據(jù)白細(xì)胞分化抗原反應(yīng)性的類型劃分為25群，把每一群抗體稱為一個分化抗體群(Cluster of Differentiation，CD)，進(jìn)行編號、命名，即為單克隆抗體的國際命名法。由CD抗體群識別的分化抗原就稱為CD分子。目前已有339個分化抗體群被鑒定并命名,,流

25、式細(xì)胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準(zhǔn)確分類計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。血液淋巴細(xì)胞是一群特異性極強(qiáng)的細(xì)胞，根據(jù)淋巴細(xì)胞的功能及膜表面標(biāo)志，主要分為T淋巴細(xì)胞(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)、NK細(xì)胞(CD16+56+/CD3-)三個亞群。,CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,T淋巴細(xì)胞（CD3+）淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞（CD19+） NK細(xì)胞（

26、CD16+56）+,,,,,NK細(xì)胞:CD(16+56)+/CD3-,B淋巴細(xì)胞:CD19+/CD3-,NK+/CD3-,CD（16+56）+/CD3+（T-cell）,CD19+/CD3+（T-cell）,CD19+/CD3-,外周血淋巴細(xì)胞亞群標(biāo)記方法（表面標(biāo)記）,50ul+10ul相應(yīng)抗體 避光孵育15min 加OptiLyes C溶血素250ul 室溫10min PBS洗

27、一次 上機(jī)分析抗體: CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三標(biāo)抗體CD19-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體CD16+56-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型對照,,,,,,淋巴細(xì)胞亞群檢測臨床意義： CD3+、CD4+、CD8+總數(shù)降低：細(xì)胞免疫功能低下 CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、

28、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）、再生障礙性貧血等 CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)降低：自身 免疫性疾、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧血 CD3+CD4+CD8+T細(xì)胞減少：見于免疫球蛋白缺乏癥、胸腺發(fā)育不良、嚴(yán)重免疫缺陷病。,NK [CD(16+56) +] 活性低下：腫瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等 NK+ [CD(16+56) +] 活性增高：多發(fā)性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾?。?/p>

29、B病毒、皰疹病毒、肺TB）、習(xí)慣性流產(chǎn)等 CD19+B細(xì)胞減少：體液免疫抑制 CD19+B細(xì)胞增高：B細(xì)胞惡性增殖性疾病（白血?。?3、 白血病免疫分型,FCM作為白血病輔助診斷，免疫分型是急白血病診斷的關(guān)鍵技術(shù)。利用不同類型的白血病具有不同抗原表達(dá)的特異性進(jìn)行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特異性等。標(biāo)記方法：往往需要胞漿和胞膜同時標(biāo)記，一線抗體包括：胞漿（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a, T淋巴系-cyCD3）,胞膜(

30、髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10, T淋巴系-CD3、CD2)等,采用CD45和側(cè)向散射(SSC）設(shè)門技術(shù)可將各細(xì)胞群分開，熒光從強(qiáng)大到弱：淋巴細(xì)胞群>單核細(xì)胞>成熟粒細(xì)胞>原/幼細(xì)胞(白血病細(xì)胞)，而成熟的紅細(xì)胞和血小板不表達(dá)。,,,,,,,正常骨髓流式細(xì)胞分布圖,,,各系表達(dá)的抗原造血干細(xì)胞：CD34、CD33髓系表達(dá) ：CD13、CD14、CD33巨核細(xì)胞 ：CD61、CD41B細(xì)

31、胞系：CD10 、CD19、CD20T細(xì)胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK細(xì)胞: CD16、CD56、CD57,4、細(xì)胞因子的檢測,細(xì)胞因子（CK）主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，也可由非免疫細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種CK，一種CK也可由多種細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞因子分為4類：白細(xì)胞介素（lL）；干擾素（IFN）；造血生長因子；腫瘤壞死因子（TNF）。,,血液中未活化的白細(xì)胞內(nèi)無或僅極小量細(xì)胞因子，當(dāng)其被各種激活劑活

32、化后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子合成增加并不斷分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用。因此，要測定細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子較為困難。通常應(yīng)用刺激劑（如：佛波脂）來刺激細(xì)胞因子分泌 ，同時加入一定濃度的細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑（如：莫能霉素），使細(xì)胞因子合成后累積在細(xì)胞內(nèi)，通過細(xì)胞因子特異的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進(jìn)行多色分析各種細(xì)胞內(nèi)合成的細(xì)胞因子。,,細(xì)胞因子檢測（IFN-r ，IL-4）：,全血或單細(xì)胞+刺激素(佛波脂)和阻斷劑(莫能霉素)

33、 37℃培養(yǎng)4-6h 加入細(xì)胞表面抗體(如CD3、CD4/CD8) 孵育20-30min PBS洗1次 加固定破膜劑 室溫15min 加入IFN- r和IL-4抗體 孵育30min PBS洗兩次 FCM。,,,,,,,,,,,結(jié)果分析：運(yùn)用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（FS）和側(cè)向散射（SS）圈出淋巴細(xì)胞，再用CD3+和SSC設(shè)門圈出T淋巴細(xì)胞，再用CD8-/CD3+設(shè)門選定T淋巴細(xì)胞亞群，

34、再分析IL-4+和CD4+/IFN-r,淋巴細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞（CD3+）,CD3+CD8-（CD4+）,IFN-r,IL-4,5、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度Ca2+超載是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，導(dǎo)致DNA降解，促使細(xì)胞凋亡。,檢測 Fluo-3/Am是高特異性Ca2+熒光指示劑，能與Ca2+特異結(jié)合。Fluo-3它本身是親水性，不易透過膜的，依賴其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨過質(zhì)膜進(jìn)入胞漿，在胞內(nèi)酯酶的作用下，脫去AM重新生成親水性

35、形式，一方面不能再進(jìn)入細(xì)胞器，另一方面易于在胞內(nèi)擴(kuò)散，與游離鈣離子結(jié)合，通過檢測其熒光強(qiáng)度可反映出細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化。 單細(xì)胞懸液+flour-3/AM 37ºC避光孵育40min PBS洗1次 上機(jī)檢測,,,,6、線粒體膜電位,線粒體膜電位（MMP）是線粒體功能的重要參數(shù)，是評價線粒體功能的敏感指標(biāo)，它的大小直接反映線粒體功能及數(shù)量，MMP下降，其氧化磷酸化功能障礙

36、，使ATP產(chǎn)生減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。,MMP檢測原理及方法：,Rhodamine123（羅丹明123）、DiOC6、JC-1等多種親脂性的陽離子熒光素都能被流式細(xì)胞分析用于作為檢測 MMP的探針。這些親脂性熒光染料，對膜具有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電位，線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)帶負(fù)電荷，當(dāng)它們與活細(xì)胞一起培養(yǎng)時，這些陽離子熒光素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就能特異地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。,當(dāng)MMP降低后，線粒體內(nèi)的熒光素會

37、發(fā)生外漏，在細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。檢測其熒光強(qiáng)度能反映線粒體數(shù)量和MMP的降低或喪失。操作：單細(xì)胞懸液（1*10 6 ）+1umol/L的Rh123 37 ºC,30min PBS洗兩次 上機(jī)檢測,,,7、 FCM檢測細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序結(jié)束其生命的過程。細(xì)胞凋亡為一種可調(diào)控的、主動的細(xì)胞死亡過程，有很多的促進(jìn)或抑制凋亡的調(diào)控途徑存在，因而就可以人為地誘導(dǎo)或抑制某些細(xì)胞的

38、凋亡，從而達(dá)到防病、治病的目的。,（1） Caspase家族,半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以無活性的酶原形式存在細(xì)胞內(nèi)，需被水解加工后才能成為有活性的片段?；罨腃aspase進(jìn)一步激活其他的Caspase前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，目前已發(fā)現(xiàn)15個Caspase家族成員，分別命名為Caspase1-15。在Caspase家族成員中，Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。,操作：單細(xì)胞懸液（

39、1*10 6） 固定和破膜劑 冰浴20min Perm/Wash Buffer洗兩次 20ul單抗 室溫孵育30min Perm/Wash Buffer洗1次 加0.5ml Perm/Wash Buffer 上機(jī)檢測。,,,,,,,（2） 凋亡相關(guān)基因蛋白,細(xì)胞凋亡過程中有多種基因蛋白參與調(diào)控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導(dǎo)凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、

40、ced基因家族等。 抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad 等 促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等 染色標(biāo)記同Caspase,（3）Fas/FasL,Fas又稱APO-1，即CD95分子，是細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，表達(dá)在各種組織細(xì)胞，是典型的細(xì)胞死亡受體。Fas/FasL是凋亡誘導(dǎo)家族的重要成員之一，是調(diào)節(jié)組織發(fā)育和體內(nèi)平衡的重要分子,Fas/FasL結(jié)合,可向細(xì)胞傳遞死亡信號,引起細(xì)胞凋亡。 檢測：

41、同表面標(biāo)記,（4） 凋亡率檢測,被認(rèn)為比較成熟的方法：,PI單染色法Annexin V／PI雙染法。TUNEL法,碘化丙啶（PI）單染法（DNA周期分析）：　　　由于凋亡細(xì)胞DNA被降解，小分子DNA可通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外，另外凋亡小體也可帶走部分DNA，造成凋亡細(xì)胞DNA含量減少，與熒光染料結(jié)合減少，熒光強(qiáng)度減弱，在DNA直方圖上顯示在G0/G1峰前出現(xiàn)一個DNA含量減少的亞二倍體峰，稱凋亡細(xì)胞峰。,,,,,,,Annex

42、in V／PI雙染法：　　　在凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變中，胞膜的改變是最早的。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)層翻轉(zhuǎn)，暴露在凋亡細(xì)胞表面，構(gòu)成早期凋亡的重要生化特征，PS被特異的Annexin V-FITC探針?biāo)鶚?biāo)記，而PI對細(xì)活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞是拒染的，故Annexin V-FITC/PI雙染法能區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。,機(jī)械損傷細(xì)胞： Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、壞死

43、細(xì)胞：Annexin V +/PI+早期凋亡細(xì)胞： Annexin V +/PI-活細(xì)胞： Annexin V -/PI-,,,,,,TUNEL法：　　　細(xì)胞凋亡時，雙鏈DNA會出現(xiàn)斷裂點(diǎn)，即產(chǎn)生一系列3` 端。在脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)催化的反應(yīng)下，能將熒光素--脫氧尿苷三磷酸(dUTP) 標(biāo)記到斷裂的DNA末端，從而使凋亡的細(xì)胞具有熒光。,FCM的臨床檢測項(xiàng)目,HLA-B27淋巴細(xì)胞亞群（CD3、CD4、CD