龍須菜熱激蛋白基因克隆及在高溫脅迫下的表達(dá)模式分析.pdf

1、龍須菜是一種重要的大型經(jīng)濟(jì)海藻,是生產(chǎn)瓊膠的原料,也可以作為鮑魚(yú)的餌料,具有進(jìn)行大規(guī)模栽培的價(jià)值。耐高溫品種981和07-2龍須菜的培育,推動(dòng)了龍須菜栽培業(yè)的發(fā)展,但是在實(shí)際栽培過(guò)程中仍然面臨過(guò)高的海水溫度會(huì)限制龍須菜的生長(zhǎng),導(dǎo)致潰爛甚至死亡等問(wèn)題。為解決這些問(wèn)題,培育性狀穩(wěn)定、耐熱性更強(qiáng)的龍須菜新品種是必要的,這需要研究龍須菜對(duì)高溫的應(yīng)答機(jī)制。研究表明,熱激蛋白(HSP)是一類在生物體受到逆境脅迫時(shí)能提高機(jī)體耐受性的逆境蛋白家族,在減

2、輕逆境脅迫對(duì)機(jī)體的傷害方面起到很大作用。本論文對(duì)龍須菜熱激蛋白進(jìn)行研究,旨在了解龍須菜的高溫脅迫響應(yīng)機(jī)制,為培育抗逆性更強(qiáng)的龍須菜新品系提供理論依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)構(gòu)建龍須菜高溫脅迫差異表達(dá)文庫(kù),獲得了龍須菜hsp90的cDNA序列,在此基礎(chǔ)上,本論文克隆了hsp90的全長(zhǎng)序列,長(zhǎng)為2605bp,只由一個(gè)外顯子組成,開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2100bp,上游調(diào)控序列為505bp。該基因編碼699個(gè)氨基酸,含有N端保守的ATPase結(jié)構(gòu)

3、域,中間結(jié)構(gòu)域和C端是保守的5肽MEEVD。經(jīng)Blast分析與角叉菜hsp90的相似性最高,達(dá)到87％。該基因序列在三種耐高溫性能不同的龍須菜-野生型、981和07-2龍須菜中序列相同,通過(guò)southern blotting驗(yàn)證該基因在三種龍須菜中拷貝數(shù)也相同,均為兩個(gè)拷貝。
　　將本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的hsp70-1和hsp70-2與GenBank中的序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)與GenBank中報(bào)道的龍須菜hsp70序列不同,可見(jiàn)龍須菜中還存在

4、第三種hsp70(命名為hsp70-3),但是對(duì)于hsp70-3僅有部分序列報(bào)道,在此基礎(chǔ)上,本論文克隆了hsp70-3的全長(zhǎng)序列,長(zhǎng)為2780bp,開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1867bp,基因上游調(diào)控區(qū)長(zhǎng)416bp,下游側(cè)翼序列長(zhǎng)495bp。該基因編碼621個(gè)氨基酸,含有保守的N端ATPase結(jié)構(gòu)域和C端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。經(jīng)Blast分析與細(xì)基江蘺hsp70的相似性最高,達(dá)到91%。
　　本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)分析10種管家基因—肌動(dòng)蛋白基因(ACT)

5、、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、延伸因子基因1(EF1)、轉(zhuǎn)錄起始因子基因(eIF)、組蛋白H2B基因(H2B)、18S核糖體RNA基因(18S rRNA)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因(ITS2)、胞色素c氧化酶基因(COX)、細(xì)胞色素還原酶b5基因(CR)、藻紅蛋白基因(PEB)在不同溫度脅迫下的表達(dá)情況,獲得了龍須菜在溫度脅迫條件下合適的內(nèi)參基因:a)32℃不同的熱激處理時(shí)間實(shí)驗(yàn),最適合的內(nèi)參基因組合是eIF和 ACT。b)8℃不同

6、的低溫處理時(shí)間實(shí)驗(yàn),最適合的內(nèi)參基因組合是GAPDH、ITS2、CR、18S rRNA。c)不同的處理溫度實(shí)驗(yàn),最合適的內(nèi)參基因組合是 eIF、 EF1、 ACT。d)龍須菜不同的生活世代實(shí)驗(yàn),最合適的內(nèi)參基因組合是 GAPDH和 ACT。
　　采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)hsp90和hsp70-3在高溫(32℃)脅迫下在野生型,07-2,981中的轉(zhuǎn)錄水平。hsp90在三種龍須菜中的變化趨勢(shì)是一樣的,均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨

7、勢(shì);從表達(dá)量上分析07-2型龍須菜中的表達(dá)量最大,981次之,野生型最低,這與三種品系龍須菜對(duì)溫度的耐受性是一致的。hsp70-3在07-2型龍須菜中是下調(diào)表達(dá)的;在野生型和981型龍須菜中表達(dá)量是上升的,而且在野生型龍須菜中表達(dá)量最高。結(jié)合顧穎慧檢測(cè)的hsp70-1、hsp70-2基因的表達(dá)情況可知,對(duì)于野生型龍須菜來(lái)說(shuō),hsp70-3可能是其響應(yīng)高溫脅迫II的主要HSP70蛋白;對(duì)于981龍須菜來(lái)說(shuō),在高溫脅迫下,其hsp70-1,

8、hsp70-2和hsp70-3均表達(dá)上調(diào),多種hsp70蛋白共同發(fā)揮作用保護(hù)細(xì)胞免受高溫傷害,這可能是981龍須菜耐高溫能力提高的原因之一。對(duì)于07-2型龍須菜,其hsp70-3的表達(dá)水平非但沒(méi)有提高,還呈現(xiàn)出下調(diào)的特點(diǎn),然而三種龍須菜中,07-2型龍須菜的高溫耐受性最強(qiáng),可能是07-2型龍須菜中其他高溫脅迫響應(yīng)元件的作用更大。
　　本文首次對(duì)高溫脅迫下龍須菜熱激蛋白hsp90和hsp70-3基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析,為闡述龍須菜高