一種新型鈣調(diào)素結(jié)合蛋白-金屬蛋白酶在龍須菜高溫脅迫中的表達(dá)模式研究.pdf

1、龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)是一種重要的產(chǎn)瓊膠經(jīng)濟(jì)海藻,原產(chǎn)于山東和遼寧,在我國(guó)已成為繼海帶和紫菜后的第三大栽培海藻。隨著龍須菜栽培業(yè)的不斷發(fā)展,對(duì)龍須菜種質(zhì)提出了更高的要求,研究者們先后選育出耐熱品種981和07-2,使得龍須菜品質(zhì)得到了不斷改良,其耐高溫性能也不斷提高,帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)生態(tài)效益。然而,在龍須菜大規(guī)模栽培中,這兩個(gè)耐高溫品系也出現(xiàn)了種質(zhì)退化現(xiàn)象,為此,迫切需要研究龍須菜在高溫脅迫

2、下的響應(yīng)機(jī)制,為選育性狀優(yōu)良、耐高溫性強(qiáng)的龍須菜新品系奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選高溫脅迫條件下鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合蛋白,得到了金屬蛋白酶(metalloproteinase of Gracilaria lemaneiformis, GlMP)的表達(dá)序列標(biāo)簽,表明金屬蛋白酶可能是龍須菜CaM信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一員,在龍須菜響應(yīng)高溫脅迫中發(fā)揮作用。本論文在此基礎(chǔ)上,首次克隆龍須菜的GlMP基因,并研究其在高溫脅迫下

3、的表達(dá)模式,為探討龍須菜對(duì)高溫脅迫下的信號(hào)傳導(dǎo)途徑打下基礎(chǔ),并為龍須菜耐高溫品系的選育提供可用的基因信息。
　　本研究以野生型、981和07-2三種龍須菜為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)RACE技術(shù)和Genome Walking方法,首次克隆了龍須菜中GlMP基因的cDNA和DNA序列全長(zhǎng)。結(jié)果表明,克隆得到的龍須菜GlMP cDNA全長(zhǎng)546bp,包括462bp的開(kāi)放閱讀框,36bp的5’ UTR以及48bp的3’ UTR。開(kāi)放閱讀框編碼153

4、個(gè)氨基酸,其中包括金屬蛋白酶的Zn2+保守結(jié)構(gòu)域HEXXH。克隆得到的龍須菜GlMP基因全長(zhǎng)1123bp,其中包含5’端側(cè)翼序列542bp,以及一個(gè)長(zhǎng)約71bp的內(nèi)含子。比較發(fā)現(xiàn)野生型、981和07-2三種龍須菜中GlMP的序列無(wú)差異。Southern雜交結(jié)果表明無(wú)論是野生型、981還是07-2,基因組中均含有2個(gè)拷貝GlMP基因。利用酵母雙雜交技術(shù)檢測(cè)表明,GlMP可以與CaM相互作用,是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。
　　通過(guò)比較3種龍

5、須菜中GlMP和CaM的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),野生型龍須菜中GlMP的表達(dá)水平高于981和07-2龍須菜,981龍須菜中CaM的表達(dá)高于其余2種品系,而3種龍須菜的耐高溫性能是07-2>981>野生型,可見(jiàn)耐高溫性能并不是由單一因子表達(dá)水平?jīng)Q定的,可能與多種耐高溫因子及它們之間的協(xié)同作用有關(guān)。龍須菜中GlMP和CaM均在32°C表達(dá)高于28°C,表明它們都可以對(duì)高溫脅迫積極響應(yīng)。
　　此外,本論文以CaM為誘餌,通過(guò)酵母雙雜交篩選到39條

6、CaM結(jié)合蛋白的基因,經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這些基因多為蛋白酶類,參與各種水解、氧化還原、脫羧等反應(yīng),并且其蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)符合鈣調(diào)素結(jié)合域(CaMBD)的特點(diǎn)。根據(jù)鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(CaMBP)數(shù)據(jù)庫(kù)分析本研究獲得的GlMP氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)其82-123位具有 CaMBD結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn),推測(cè)為鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)域,為了驗(yàn)證該區(qū)域,本研究將GlMP的氨基酸序列分為4部分-CaMBD部分(表示為Most),CaMBD上游部分(表示為Front),

7、CaMBD下游部分(表示為L(zhǎng)ast)和全長(zhǎng)GlMP(表示為Whole),分別將這四部分與CaM采用酵母雙雜交進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示Most和Whole部分菌落變藍(lán),而Front和Last部分沒(méi)有變藍(lán),表明軟件預(yù)測(cè)的GlMP中82-123位的氨基酸區(qū)域是CaMBD,GlMP是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。
　　本研究為探討龍須菜的CaM信號(hào)系統(tǒng)在高溫脅迫下的作用元件和作用過(guò)程,并為進(jìn)一步揭示龍須菜的高溫脅迫分子響應(yīng)機(jī)理以及耐高溫新品種的選育奠定基