三種海帶多糖結(jié)構(gòu)鑒定及其抗動脈粥樣硬化活性和免疫調(diào)節(jié)活性調(diào)控機制的研究.pdf

1、海帶是一種重要的藥食兩用海洋資源,富含生物活性多糖。本文主要開展了抗動脈粥樣硬化和免疫調(diào)節(jié)活性海帶多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定方面的研究,獲得了如下實驗結(jié)果:
　　(1)海帶多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)鑒定:采用DEAE-Cellulose離子交換色譜、Sephacryl S-500凝膠滲透色譜技術(shù)對海帶總多糖進行分離純化,獲得3個多糖均一組分 LJP11、LJP12和LJP31,分子量分別為2.45×107 Da、1.8×107 Da、1

2、.1×107Da。單糖組成分析及甲基化分析得到,LJP11主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成,分子摩爾比為1:1.16:6.33,主鏈主要包含1,4-β-D-Glcp、1,4-2-O-acetyl-β-D-Glcp、1,3,6-α-D-Manp和1-β-L-Araf。LJP12主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,分子摩爾比為1:0.17:1.54:2.64:0.18,主鏈主要包含1,3,6-α-D-Manp、1-α-D-G

3、alp、1,4-2-O-acetyl-β-D-Manp、1,4-β-D-Glcp和1-β-L-Araf。LJP31主要由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,分子摩爾比為1:7.8:6.6:0.8,主鏈主要包含1,4-2-O-acetyl-β-D-Manp、1,3,6-α-D-Manp、1,4-β-D-Glcp、1-β-L-Araf、1-α-D-Glap和1,4-β-D-Manp。
　　(2)LJP11的免疫調(diào)節(jié)活性及作用機理:M

4、TT實驗顯示,在考察濃度范圍內(nèi),LJP11顯著促進RAW264.7細胞的生長(p<0.01)。培養(yǎng)液中NO和細胞因子的含量分析顯示,LJP11不僅能促進巨噬細胞產(chǎn)生NO、TNF-α和IL-6,而且能抑制IL-10的分泌,當多糖濃度為200μg/mL時,NO、TNF-α和IL-10的分泌量達到最大,分別比對照組提高了77％、12.6%和19.7%,當多糖濃度為100μg/mL時, IL-6的分泌量分別達到最大。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),LJ

5、P11對RAW264.7細胞產(chǎn)生NO和細胞因子的影響與其調(diào)控相關(guān)蛋白的基因表達密切相關(guān),當多糖濃度達到200μg/mL時,iNOs、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10 mRNA表達分別比對照組提高了65.7%、75.3%、270%、120%和16.9%。Western blot結(jié)果顯示, LJP11有助于促進RAW264.7細胞NF-κB p65蛋白發(fā)生核遷移和IκB蛋白的磷酸化,提示LJP11能夠激活RAW264.7細胞NF

6、-κB信號通路, LJP11能顯著促進細胞JNK、ERK1/2和P38蛋白的磷酸化,提示該多糖能從活化JNK、ERK1/2和P38三方面激活MAPK信號通路。這些結(jié)果表明,對炎性信號通路MAPK和NF-κB的調(diào)控作用是LJP11免疫調(diào)節(jié)活性的重要分子機制。
　　(3)LJP12的抗動脈粥樣硬化活性及其分子調(diào)控機制:病理學(xué)研究顯示,海帶多糖LJP12能顯著抑制高脂飼料誘導(dǎo)的LDLr-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,呈量效關(guān)系。當L

7、JP12劑量達到200 mg/kg·day時,血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、NO、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1含量分別比高脂飼料組減小了58.2%、46.0%、50.9%、61.2%、57.3%、28.0%、37.4%、22.8%、36.0%、21.1%、24%和32.3%,而SOD、IL-10分別比高脂飼料組提高了57.3%和80%;血管中促炎因子TNF-α、IL-1β、I

8、CAM-1和MCP-1的mRNA表達比對照組降低了86.6%、93.5%、82.1%和67.7%,而抗炎因子IL-10的mRNA表達是對照組的21.3倍。Western blot分析發(fā)現(xiàn),LJP12能顯著抑制血管中NF-κB p65、JNK、ERK1/2和P38等蛋白的磷酸化,其中多糖劑量為200 mg/kg·day時,它們分別比對照組降低了70%、87.1%、51.8%和58.3%。這些結(jié)果表明,LJP12可能是通過抑制NF-κB和M

9、APK信號通路,抑制促炎因子的表達,進而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。
　　(4)LJP31的免疫活性及作用機理:MTT實驗表明,在實驗濃度范圍內(nèi)(50~400μg/mL),LJP31對RAW264.7細胞無毒性作用。培養(yǎng)液中NO和細胞因子的含量分析顯示,LJP31不僅能促進巨噬細胞產(chǎn)生NO、TNF-α和IL-6,而且能抑制IL-10的分泌,當多糖濃度為200μg/mL時,TNF-α和IL-6的分泌量達到最大,分別比對照組提高了13

10、.8%、200%和21.4%,當多糖濃度為100μg/mL時,NO的分泌量分別達到最大。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn), LJP31對RAW264.7細胞產(chǎn)生NO和細胞因子的影響與其調(diào)控相關(guān)蛋白的基因表達密切相關(guān),當多糖濃度達到200μg/mL時,iNOs、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10mRNA表達分別比對照組提高了59%、410%、300%、120%和26%。Western blot結(jié)果顯示, LJP31有助于促進RAW264.

11、7細胞NF-κB p65蛋白發(fā)生核遷移和IκB蛋白的磷酸化,提示LJP31能夠激活RAW264.7細胞NF-κB信號通路,LJP31能顯著促進細胞JNK、ERK1/2和P38蛋白的磷酸化,提示該多糖能從活化JNK、ERK1/2和P38三方面激活MAPK信號通路。流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡分析發(fā)現(xiàn), TLR4是LJP31作用于RAW264.7細胞的細胞表面特異性靶分子。這些結(jié)果表明,LJP31可以通過識別RAW264.7細胞表面的TLR