南蛇藤生物活性成分分析及其抗動(dòng)脈粥樣硬化藥效評(píng)價(jià).pdf

1、1.毛細(xì)管電泳法分析南蛇藤中黃酮類物質(zhì)成分及其含量分布
　　 建立同時(shí)測(cè)定南蛇藤中蘆丁、山奈酚及槲皮素含量的毛細(xì)管電泳法，分析結(jié)果差異，探討南蛇藤的藥用質(zhì)量控制方法:采用30 mmol·L-1硼酸鈉緩沖液(PH=9.0)，20kV分離電壓條件下，254nm波長(zhǎng)下毛細(xì)管電泳法測(cè)定蘆丁、山萘酚、槲皮素含量。結(jié)果黃酮類物質(zhì)蘆丁、山萘酚和槲皮素的對(duì)照品在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離，在2.5-500μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系:

2、YRT=841.7C+4919.3(r=0.998)；YKF=2599.1C+12999(r=0.999)；YQC=5111.8C+13570(r=0.999)。蘆丁在皮、葉中含量高達(dá)1.41、1.37mg·g-1；山奈酚在皮中含量高達(dá)2.16 mg·g-1；槲皮素在根中含量可達(dá)0.016mg·g-1。研究表明南蛇藤中黃酮類物質(zhì)含量豐富，不同部位中各黃酮含量有明顯差異。毛細(xì)管電泳技術(shù)同時(shí)測(cè)定南蛇藤中蘆丁、山奈酚與槲皮素具有較好的準(zhǔn)確度和

3、精密性，為臨床和科研提供了一種簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)方法，同時(shí)為南蛇藤的藥用質(zhì)量控制提供了技術(shù)方法和堅(jiān)實(shí)的理論數(shù)據(jù)。
　　 2.超聲波提取-毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用優(yōu)化南蛇藤中熊果酸與齊墩果酸提取工藝及其含量測(cè)定
　　 超聲波技術(shù)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化南蛇藤中熊果酸與齊墩果酸的提取工藝，建立一種毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定南蛇藤中熊果酸和齊墩果酸含量的方法，并檢測(cè)熊果酸與齊墩果酸在南蛇藤不同部位中的含量分布:分別以提取溶劑濃度、料液比、超聲時(shí)間為考

4、察因素，采用三因素三水平設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化熊果酸與齊墩果酸的提取工藝。以硼酸鹽緩沖液濃度、pH值、分離電壓為考察因素，篩選熊果酸與齊墩果酸的最佳分離條件。結(jié)果熊果酸和齊墩果酸的最佳提取條件為:以80％甲醇為提取溶劑，料液比(m/v)為1∶20，超聲時(shí)間50min。以80mmol· L-1的硼酸鹽緩沖液(pH=9.80)作為電離介質(zhì)，20 kV分離電壓，210 nm波長(zhǎng)下，22 min內(nèi)熊果酸和齊墩果酸得到很好的分離。二者線性方程分別

5、為:YUA=300801x+1210.5(r=0.9992)和YOA=349265x+4118.3(r=0.9992)，檢測(cè)范圍分別為0.0624-0.187μg·μL-1，0.0348-0.1043μg·μL-1，回收率分別為97.23％、96.45％，變異系數(shù)(RSD)＜5.00％(n=6)。熊果酸在根中含量為0.37 mg·g-1，約為葉中的5.5倍。齊墩果酸在莖、皮中的含量為0.67、0.52 mg·g-1，約為葉中的3.7倍和

6、2.8倍。超聲技術(shù)-響應(yīng)曲面優(yōu)化熊果酸與齊墩果酸的提取工藝，毛細(xì)管電泳同時(shí)檢測(cè)熊果酸與齊墩果酸含量，具有較好的準(zhǔn)確度和精密性，為臨床和科研提供了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。熊果酸與齊墩果酸在南蛇藤根、莖、葉、皮中均有分布，且不同部位中含量存在明顯差異。
　　 3.超聲波提取-毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用優(yōu)化南蛇藤中南蛇藤素的提取工藝及其含量測(cè)定
　　 超聲波提取-響應(yīng)曲面法優(yōu)化南蛇藤中南蛇藤素的提取工藝，建立毛細(xì)管電泳法測(cè)定南

7、蛇藤素含量的方法并檢測(cè)其在南蛇藤不同部位中的分布:分別以提取溶劑濃度、料液比、超聲時(shí)間為考察因素，采用三因素三水平設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化南蛇藤素的提取工藝。以硼酸鹽緩沖液濃度、pH值、分離電壓為考察因素，篩選南蛇藤素的最佳電泳分離條件。結(jié)果南蛇藤素的最佳提取條件為:80％甲醇為提取溶劑，料液比（m/v）為1∶20，超聲時(shí)間50min。以10％甲醇和70 mmol· L-1硼酸鹽緩沖液(pH=9.00)作為電解液，分離電壓22 kV，檢測(cè)

8、波長(zhǎng)210 nm作為檢測(cè)條件。南蛇藤素在15min內(nèi)得到分離，YCL=543282x+1967.2(r=0.9920)，線性檢測(cè)范圍為0.039-0.117μg·μL-1?；厥章蕿?01.13％，變異系數(shù)(RSD)＜4.00％(n=6)。南蛇藤素在根、莖、皮、葉中的含量分別為5.13、1.51、0.32、0.34 mg·g-1。南蛇藤素主要存在于根中，約為莖中的3.4倍，皮和葉的15倍。南蛇藤素在南蛇藤根、莖、葉、皮中均有分布，且不同部

9、位中含量存在明顯差異。超聲波提取-響應(yīng)曲面法優(yōu)化南蛇藤素的提取工藝，同時(shí)毛細(xì)管電泳檢測(cè)其含量，具有較好的準(zhǔn)確度和精密性，為臨床和科研提供了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，同時(shí)為臨床用藥提供了參考數(shù)據(jù)。
　　 4.南蛇藤醇提物毒性和安全性實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究中藥南蛇藤醇提物的藥物毒性和安全性:采用Kaerben法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，尋找小鼠灌胃給予南蛇藤醇提物的最大耐受量(MTD)和半數(shù)致死量(LD50);在MTD范圍內(nèi)，灌胃給

10、予小鼠0.0、2.5、5.0、10.0 g·kg-1南蛇藤醇提物21d，記錄藥物對(duì)小鼠毒副作用情況，分析肝臟形態(tài)及肝臟指數(shù)變化，酶法檢測(cè)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。結(jié)果表明南蛇藤醇提物的MTD為10.0 g·kg-1，LD50為38.17 g·kg-1，95％可信限為38.14-38.19 g·kg-1。在MTD范圍內(nèi)灌胃給藥，與對(duì)照組相比，肝臟形態(tài)學(xué)和肝臟指數(shù)無明顯變化;5.0、10.0 g·kg-1組

11、ALT升高顯著(P＜0.01，P＜0.001)，10 g·kg-1組AST明顯升高(P＜0.01）。因此確定南蛇藤醇提物最大耐受量為10.0 g·kg-1，在此范圍內(nèi)用藥對(duì)機(jī)體毒性較小，能保證用藥安全。
　　 5.南蛇藤改善高脂血癥豚鼠血脂表型和減輕主動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積
　　 探討南蛇藤對(duì)高脂血癥豚鼠脂質(zhì)代謝、動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積的作用及機(jī)制:48只英格蘭雄性短毛豚鼠(260-310 g，5月齡)隨機(jī)分為普通飲食對(duì)照組(CD)，高

12、脂飲食模型組(HFD)，南蛇藤3個(gè)濃度處理組，即低劑量組(HFD-L，2.5 g·kg-1·d-1)、中劑量組(HFD-M，5.0 g·kg-1·d-1)和高劑量組(HFD-H，10.0 g·kg-1·d-1)，以及辛伐他汀組(HFD-S，20m g·kg-1·d-1)。連續(xù)藥物干預(yù)8周后，測(cè)定血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)含量。快速蛋白分析(FPLC

13、)技術(shù)分離血漿組分，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)分析極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和HDL-C的蛋白組分。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析肝臟膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因清道夫受體-BI(SR-BI)、低密度脂蛋白受體(LDL-R)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase)和膽固醇7α-羥化酶1(CYP7α-1)表達(dá)。分別采用油紅O染色和HE染色分析主動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉

14、積與肝臟脂肪性病變。采用Applygen試劑盒測(cè)定肝臟中TC、TG、游離膽固醇(FC)、膽固醇酯(CE)。結(jié)果顯示，與高脂模型組比較，南蛇藤高劑量組TC、TG和Non-HDL-C分別下降45％，21％和49％，南蛇藤中、高劑量組分別升高HDL-C16％和20％。LDL和VLDL中apoB和apoE表達(dá)顯著降低，而HDL中apoAⅠ表達(dá)明顯增加;南蛇藤可顯著上調(diào)SR-BI、LDL-R、CYP7α1和HMG-CoA mRNA水平。南蛇藤顯著