中藥虎杖抗動脈粥樣硬化活性成分的初步篩選.pdf

1、眾所周知，心血管疾病已經(jīng)成為公認(rèn)的全球第一殺手，動脈粥樣硬化是最常見的心血管疾病之一，在我國的發(fā)病率也逐年增高，已經(jīng)成為導(dǎo)致成年人死亡的主要誘因。動脈粥樣硬化是以脂質(zhì)代謝失調(diào)為主，在其他多種慢性應(yīng)激因素共同作用下，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷，進而形成的慢性非特異性血管性疾病。
　　大量臨床統(tǒng)計資料顯示:人和動物的動脈粥樣硬化斑塊中出現(xiàn)大量鞘磷脂蓄積，同時證實人血漿鞘磷脂水平和鞘磷脂/卵磷脂比例與冠心病的發(fā)生率密切相關(guān)。因此，鞘磷脂的調(diào)控

2、有望實現(xiàn)動脈粥樣硬化的治療。血漿鞘磷脂水平與脂蛋白代謝以及動脈粥樣硬化的發(fā)生有密切關(guān)系。鞘磷脂合成酶處于鞘磷脂體內(nèi)合成路徑上的最后一步，能夠催化神經(jīng)酰胺和卵磷脂生成鞘磷脂和甘油二酯，從而控制著細(xì)胞內(nèi)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、甘油二酯和卵磷脂的含量，進而直接影響到動脈粥樣硬化的病理進程。因此，基于鞘磷脂合成酶為作用靶點的抗動脈粥樣硬化研究及其抑制劑的研發(fā)，已成為該領(lǐng)域新的研究熱點之一。
　　從中草藥中尋找抗動脈粥樣硬化的有效藥物一直備受關(guān)注

3、，因此研究中醫(yī)藥抗動脈粥樣硬化的機制，從細(xì)胞和分子水平開展前瞻性的基礎(chǔ)實驗研究，可望給動脈粥樣硬化及動脈粥樣硬化相關(guān)性疾病的中醫(yī)藥治療帶來突破性進展。
　　現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，與細(xì)胞膜上的受體或通道結(jié)合是藥物發(fā)揮作用的第一步，因此藥物與細(xì)胞結(jié)合是藥物能夠發(fā)揮作用的重要步驟?；谶@一原理，以細(xì)胞膜為固定相的細(xì)胞膜色譜，以及以相關(guān)受體和抗體為固定相的親和色譜已經(jīng)被用于藥理學(xué)研究，對藥物活性成分進行快速的分離和鑒定。
　　傳統(tǒng)中草

4、藥虎杖為蓼科植物虎杖(polygonum cuspidatum sieb.etzucc.)的干燥根莖和根。臨床用于治療動脈粥樣硬化、高血壓、咳嗽以及化膿性皮炎。本課題結(jié)合肝細(xì)胞膜模型和高表達鞘磷脂合酶的活細(xì)胞提取法對虎杖抗動脈粥樣硬化活性成分進行了初步篩選。
　　論文第一部分我們建立了中藥虎杖提取液的高效液相色譜測定法。采用YMC-Pack ODS-A(250×4.6 mm I.D.，5μm)色譜柱，0.5％乙酸水溶液-乙腈流動相

5、梯度洗脫290nm紫外檢測的分析方法，進行了虎杖提取液中組分的分離與測定。并對購買到的9種單體進行了方法驗證。通過對線性范圍，檢測限、定量限，精密度，準(zhǔn)確度，重復(fù)性和穩(wěn)定性的考察，顯示建立的方法靈敏度高，專屬性強。由于對照品的限制，我們又采用超高壓液相色譜高分辨二級質(zhì)譜聯(lián)用的方法，進一步對虎杖中相關(guān)組分進行確證，結(jié)合對照品及質(zhì)譜方法共確定出虎杖提取液14種組分。限于提取方法和藥物濃度限制，本文對提取液中檢測出的11種組分進行了較為詳細(xì)的

6、研究。
　　論文第二部分我們選擇大鼠肝細(xì)胞膜作為篩選模型，對虎杖提取物中的潛在活性成分進行篩選，通過分析比較虎杖提取物與肝細(xì)胞膜作用前后的結(jié)果，根據(jù)色譜圖中組分峰面積的變化情況判斷藥物與肝細(xì)胞膜的作用程度，由此篩選出能與肝細(xì)胞膜結(jié)合的組分，預(yù)測虎杖的活性成分。采用上述方法對虎杖提取物中組分進行研究，共鑒定出11種組分可以與肝細(xì)胞膜特異性結(jié)合:分別是3，5，4'-三羥基二苯乙烯-3-O-(6”-沒食子?；?-葡萄糖苷、大黃素-1-O

7、-葡萄糖苷、大黃素-8-O-(6'-丙二?；?-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-(6'-乙?；?-葡萄糖苷、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃素和大黃素甲醚。為提高篩選特異性，進一步確證虎杖中的抗動脈粥樣硬化活性成分，論文第三部分我們選擇了高表達鞘磷脂酶的細(xì)胞作為篩選模型，結(jié)合活細(xì)胞提取方法對虎杖中潛在活性成分進行篩選。活體細(xì)胞在適宜條件下與虎杖提取物相互作用，潛在的活性成分

8、會與細(xì)胞結(jié)合或進入細(xì)胞，通過反復(fù)洗滌除去表面吸附的組分后，在超聲條件下使細(xì)胞變性，提取出與其作用的組分，進行分離和鑒定。從中鑒定出八個組分，分別是:虎杖苷、3，5，4‘-三羥基二苯乙烯-3-O-(6“-沒食子?；?-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚?；罴?xì)胞條件更加接近機體中的環(huán)境，以上結(jié)果進一步驗證了細(xì)胞膜模型的篩選結(jié)果。其中化合物虎杖苷，白