抑制縫隙連接蛋白43促進(jìn)新生大鼠腦缺血損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù).pdf

1、本文對抑制縫隙連接蛋白43促進(jìn)新生大鼠腦缺血損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：Cx43模擬肽對新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護(hù)作用。
　　目的：⑴觀察新生大鼠缺血缺氧損傷后縫隙連接蛋白43(Cx43)1周內(nèi)的含量變化；⑵觀察Cx43模擬肽對新生大鼠腦缺血缺氧損傷是否具有保護(hù)作用。
　　方法：出生7天的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、假手術(shù)+Gap26(Sham+Gap26)組、缺血缺

2、氧(HI)組和缺血缺氧+Gap26（HI+Gap26）組，建立新生大鼠缺血缺氧(the hypoxia/ischemia model，HI)模型，取缺血損傷側(cè)腦組織為標(biāo)本，采用Western blot法測定缺血缺氧1周內(nèi)Cx43蛋白的表達(dá);觀察缺氧前1小時給予Gap26（不同給藥劑量）處理對新生大鼠腦梗死體積的影響以及缺血缺氧后連續(xù)給藥1周對新生大鼠遠(yuǎn)期神經(jīng)行為功能的影響。
　　結(jié)果：①Cx43在缺血缺氧4小時后開始增加，在8小時

3、后明顯增加，并隨著時間的延長持續(xù)增加;在缺血缺氧后1周，Cx43含量相對于假手術(shù)組增加了18倍左右。②與手術(shù)組相比，經(jīng)Gap26處理后大鼠的腦梗死體積明顯減小，神經(jīng)行為功能明顯增強(qiáng)。缺氧前1小時腹腔預(yù)給予Gap2625μg/kg，48小時后腦梗塞體積減小了24.56％;且該神經(jīng)保護(hù)作用具有劑量依賴性。另一Cx43模擬肽Gap27(25μg/kg)預(yù)處理，相對于手術(shù)組同樣減少腦梗塞體積26.21％左右。缺血缺氧后連續(xù)給藥1周，分別于第2、

4、3、4周進(jìn)行前爪抓握實驗和足錯誤實驗，第4周進(jìn)行水迷宮實驗，給藥組大鼠的抓握能力、平衡能力以及學(xué)習(xí)記憶功能明顯優(yōu)于手術(shù)組，各項神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);4周后給藥組大鼠的半腦損失量明顯低于手術(shù)組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：⑴新生大鼠缺血缺氧后，腦組織Cx43含量明顯增加，并且存在時間依賴性。說明Cx43蛋白含量在新生大鼠缺血缺氧早期（24小時）及晚期（24小時后）的病理生理學(xué)變化中均起到重要的作用。⑵使用

5、Gap26干預(yù)新生大鼠HI模型，大鼠的腦梗死體積明顯減小，遠(yuǎn)期神經(jīng)行為功能缺損明顯減輕。這些均提示Gap26對新生大鼠腦缺血缺氧損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分：Cx43模擬肽對新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　目的：⑴觀察Gap26對新生大鼠缺血缺氧損傷后腦組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)、細(xì)胞外谷氨酸含量、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)的影響；⑵研究Gap26對新生大鼠及元代星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷后Cx43的過量

6、表達(dá)的影響以及兩者相互作用的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：①將出生7天的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、假手術(shù)+Gap26（Sham+ Gap26）組、缺血缺氧(HI)組和缺血缺氧+Gap26（HI+Gap26）組，建立HI模型，取缺血損傷側(cè)腦組織為標(biāo)本:采用Western blot法檢測Cx43、GFAP、CleavedCaspase-3的表達(dá);采用微透析方法提取新生大鼠活體腦組織細(xì)胞外液，利用高效液相色譜法(HPLC)測定腦

7、組織及其細(xì)胞外透析液中谷氨酸的含量;采用免疫共沉淀法檢測腦組織勻漿中的Cx43與生物素(biotin)標(biāo)記的Gap26有無相互作用關(guān)系;采用免疫熒光染色法觀察各實驗組腦組織冰凍切片星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、Cx43的表達(dá)以及biotin-Gap26與Cx43定位關(guān)系。②將出生2天的SD大鼠取元代星形膠質(zhì)細(xì)胞種板，隨機(jī)分為對照(Con)組、對照+Gap26（Con+Gap26）組、氧糖剝奪(OGD)組和氧糖剝奪+Gap26（OGD+ Gap26

8、）組，制作細(xì)胞氧糖剝奪(OGD)模型，觀察缺氧前給予Gap26處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷的影響:通過Westwen blot法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷后各實驗組不同時間點(diǎn)不同處理方法下Cx43、Akt、p-Akt的表達(dá)水平;利用交聯(lián)劑BS3標(biāo)記細(xì)胞膜表面蛋白;采用免疫熒光染色法觀察細(xì)胞爬片上星形膠質(zhì)細(xì)胞biotin-Gap26與Cx43定位關(guān)系;采用MTT方法檢測各實驗組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力;采用免疫共沉淀法檢測各實驗組泛素化Cx43的含量

9、。
　　結(jié)果：⑴Gap26明顯降低腦缺血損傷后Cx43、GFAP和Cleaved Caspase-3的過量表達(dá)(P＜0.05)，減少缺血損傷側(cè)腦組織及其細(xì)胞外液谷氨酸的含量(P＜0.05);熒光染色顯示Gap26抑制HI組星形膠質(zhì)細(xì)胞過度激活以及Cx43的過量表達(dá)，Cx43與biotin-Gap26在腦組織有共定位關(guān)系;免疫共沉淀法檢測腦組織勻漿中的Cx43與biotin-Gap26有相互作用關(guān)系，而作為對照組的biotin-P5

10、則與Cx43沒有相關(guān)性。⑵Cx43與biotin-Gap26在星形膠質(zhì)細(xì)胞存在共定位關(guān)系;Gap26/Gap27明顯降低Cx43的表達(dá)(P＜0.05)，同樣可以減少小分子Cx43在OGD損傷后的過量表達(dá)，但對細(xì)胞膜表面和胞漿的Cx43具有不同的作用;Gap26顯著升高OGD損傷后p-Akt的表達(dá)以及泛素化Cx43的含量(P＜0.05)，PI3K特異性抑制劑LY294002、蛋白酶體抑制劑MG132以及溶酶體抑制劑氯喹均能在不同程度上抑制

11、Cx43的降解以及PI3K/Akt通路的激活，降低Gap26對細(xì)胞的保護(hù)作用，以LY294002、MG132作用為著(P＜0.05);免疫共沉淀結(jié)果顯示LY294002部分抑制了Cx43的泛素化水平。
　　結(jié)論：①Gap26對新生大鼠缺血缺氧損傷的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制與抑制細(xì)胞外毒性水平的谷氨酸的釋放、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。②Gap26主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解缺血缺氧損傷后過度表達(dá)的Cx43，這種作用依