骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞靜脈移植對(duì)腦缺血損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響.pdf

1、缺血性腦血管病的發(fā)病率正逐年增高，這種疾病對(duì)人類健康乃至生命的威脅使其愈來(lái)愈受到關(guān)注。急性腦缺血后，因缺血灶神經(jīng)細(xì)胞死亡而導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損至今尚缺乏真正有效的治療措施和藥物，因此如何促進(jìn)腦缺血患者受損神經(jīng)功能的修復(fù)仍是目前研究的重點(diǎn)。九十年代初神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的發(fā)現(xiàn)，打破了神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀念，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)注入了新的活力。NSCs的發(fā)現(xiàn)提示腦組織自身修復(fù)功能的存在，腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的激活有助于受損神經(jīng)功能

2、的恢復(fù)，但其新生的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量有限，使受損細(xì)胞不能為足夠的新生細(xì)胞所替代，這種修復(fù)有其限制性。另外，外源性NSCs移植也可用于修復(fù)受損的神經(jīng)功能，但由于神經(jīng)干細(xì)胞取材、培養(yǎng)困難，而且有免疫排斥、來(lái)源受限、倫理道德的約束限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。而骨髓來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow-derived MeSellchymal Stromal Cells，MSCs)具有取材、培養(yǎng)方便，可取自體骨髓進(jìn)行自體移植，并有多種分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，

3、因此MSCs如果在腦內(nèi)能夠大量分化成功能性神經(jīng)細(xì)胞，將是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的較為理想的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)成年大鼠局灶性腦缺血發(fā)生后靜脈注射移植間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)初步闡明MSCs在大鼠腦內(nèi)增殖、遷移和分化的具體過(guò)程及其修復(fù)受損神經(jīng)功能的效果、機(jī)制，從而能為MSCs移植治療局灶性腦缺血疾病提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．從2月齡Sprague-Dawley大鼠的長(zhǎng)骨中取出骨髓細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，利用MSCs

4、的貼壁生長(zhǎng)特性，通過(guò)換液棄除懸浮生長(zhǎng)的血細(xì)胞，將MSCs分離出來(lái)進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及純化。因?yàn)橘N壁細(xì)胞可能同時(shí)混有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，故在細(xì)胞傳代時(shí)控制胰蛋白酶的消化時(shí)間在2-3min，在該時(shí)間段內(nèi)絕大部分MSCs可以從培養(yǎng)瓶上脫落，而淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞貼附性強(qiáng)仍貼附在培養(yǎng)瓶底。從而使MSCs得以進(jìn)一步純化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs表面CD90/CD45表達(dá)情況來(lái)鑒定第三代MSCs，并通過(guò)體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞進(jìn)一步鑒定。取第3-4代MS

5、Cs用于實(shí)驗(yàn)。 2．健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為MCAO移植組、MCAO對(duì)照組。每組20只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型，以大鼠神經(jīng)功能障礙的出現(xiàn)作為腦缺血的整體評(píng)價(jià)，采用HE和TTC染色判斷腦缺血的部位及范圍。模型成功后第5d，MCAO移植組大鼠經(jīng)股靜脈注射總體積lml的MSCs單細(xì)胞懸液(含4×10<'6>個(gè)MSCs)，對(duì)照組以lml無(wú)血清培養(yǎng)液取代，然后進(jìn)行下列處理：①根據(jù)神經(jīng)缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于大鼠MCAO術(shù)前，術(shù)后1

6、、7、14、21d分別進(jìn)行神經(jīng)缺損評(píng)分；②MCAO術(shù)后21d各組大鼠隨機(jī)取5只做大腦TTC染色和梗死面積計(jì)算；③各組大鼠按：MCAO術(shù)后不同的飼養(yǎng)時(shí)間分別于第7d、14d、21d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取5只處死。在第6d、13d、20d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠腹腔注射5-嗅尿嘧啶(BrdtJ)以標(biāo)記增殖細(xì)胞，在最后一次注射后1d隨機(jī)取5只處死，灌注取腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作石蠟切片。選用5-嗅尿嘧啶(BrdU)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠

7、質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為增殖、分化的標(biāo)記物。免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞、BrdU和NSE雙陽(yáng)性細(xì)胞以及BrdU和GFAP雙陽(yáng)性細(xì)胞。依據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果分析腦缺血后兩組大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活情況，MSCs在腦內(nèi)增殖、遷移和分化情況，以及兩組大鼠受損神經(jīng)功能修復(fù)的效果和機(jī)制。 結(jié)果： 1．通過(guò)換液、傳代，MSCs得到了純化。用抗CD45/CD90抗體通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)第三代MSCs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面標(biāo)志CD

8、90表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞已占到93﹪，細(xì)胞表面標(biāo)志CD45表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞為1.7﹪，說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs且純度已達(dá)93﹪以上。而且向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中顯示，誘導(dǎo)14d時(shí)的細(xì)胞用脂肪特異性結(jié)合的染料油紅-O染色，結(jié)果大部分細(xì)胞的胞質(zhì)中的脂滴都被染為紅色，結(jié)果表明，該細(xì)胞在體外還可以向脂肪細(xì)胞分化。因此進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞確為間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，排除造血干細(xì)胞的可能性。 2.應(yīng)用線栓法閉塞大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈后，大鼠出現(xiàn)以右上肢

9、為重的右側(cè)偏身癱瘓同時(shí)伴有左側(cè)Homor氏征。TTC和HE染色均顯示缺血區(qū)域位于左側(cè)紋狀體、顳頂區(qū)皮層，位置和范圍較為穩(wěn)定。 3.大鼠MCAO后21 d， MSCs移植組與對(duì)照組相比梗死體積差異無(wú)顯著性。局灶性腦缺血再灌注后14、21d，MSCs移植組神經(jīng)缺損評(píng)分明顯低于對(duì)照組(P值小于0.05)。 4.在同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到側(cè)腦室SVZ處、缺血灶及周邊腦區(qū)BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞、BrdU+GFAP和BrdU+NSE雙標(biāo)陽(yáng)

10、性細(xì)胞的數(shù)量，都是移植組明顯多于對(duì)照組。經(jīng)靜脈注射移植的MSCs主要遷移到了缺血灶及周邊腦區(qū)、存活并增殖，部分MSCs可以分化為神經(jīng)元樣和星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，這些細(xì)胞主要分布于缺血區(qū)域的周圍。 5.MSCs組梗死區(qū)周圍GFAP陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組在MCAO后14、21d這兩時(shí)間點(diǎn)比較都明顯減少。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)用直接貼壁分離法從SD大鼠長(zhǎng)骨中分離出間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞并在體外培養(yǎng)成功，獲得具有增殖分化能力的純化的間充質(zhì)

11、基質(zhì)細(xì)胞。 2.大鼠線栓法MCAO模型是研究局灶性腦缺血后自身修復(fù)和內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活理想的動(dòng)物模型。腦缺血后大鼠側(cè)腦室SVZ內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖增加，BrdU染色證實(shí)這些細(xì)胞部分處于增殖狀態(tài)，遷移至缺血灶及周邊腦區(qū)，可逐漸分化為成熟的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。 3.腦缺血大鼠通過(guò)靜脈移植MSCs后，植入的細(xì)胞在缺血灶及周邊腦區(qū)增殖、遷移及分化并可能部分替代受損細(xì)胞，同時(shí)可能通過(guò)加強(qiáng)受體神經(jīng)發(fā)生區(qū)干細(xì)胞的激活、抑制膠質(zhì)瘢痕