骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)及Nogo受體表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：腦梗死又稱缺血性腦卒中，是腦血管病的最常見(jiàn)類型，約占全部腦血管病的70％。中風(fēng)后，腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損。腦梗死后神經(jīng)的再生問(wèn)題，日益受到關(guān)注。目前研究表明，早期神經(jīng)元再生失敗的主要原因是存在Nogo、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(Omgp)等髓磷脂抑制物的過(guò)表達(dá)。這類抑制物與共同的受體——Nogo受體(Nogo Recepotr,NgR)結(jié)合，通過(guò)Rho-ROCK途徑產(chǎn)生神經(jīng)再生抑制作用

2、，所以近年來(lái)Nogo或NgR成為了神經(jīng)修復(fù)研究的新靶點(diǎn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，抑制Nogo或NgR后，健側(cè)腦皮質(zhì)發(fā)射到腦干及對(duì)側(cè)脊髓的神經(jīng)纖維突起可出現(xiàn)代償性增生，從而在解剖學(xué)上起代償性修復(fù)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)在含有神經(jīng)蛋白聚糖(CSPG)、MAG及Nogo-A的培養(yǎng)液中可出現(xiàn)軸突生長(zhǎng)受到抑制，也揭示了Nogo在神經(jīng)再生中的作用。更有趣的是，DRG與MSCs條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后，可減輕上述抑

3、制物對(duì)DRG神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制。這提示我們，MSC移植可能通過(guò)以下途徑促進(jìn)神經(jīng)突起的再生：分泌營(yíng)養(yǎng)因子刺激神經(jīng)生長(zhǎng)；也可能通過(guò)抑制細(xì)胞外的神經(jīng)抑制因子起作用。目前MSCs移植修復(fù)腦梗死已證明可能有以下機(jī)制：細(xì)胞替代作用；促進(jìn)內(nèi)生源神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及遷移；分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)新生血管生成，保護(hù)梗死后半暗區(qū)的神經(jīng)元免于死亡，促使軸突生長(zhǎng)。其中，MSCs促進(jìn)神經(jīng)再生的現(xiàn)象是否通過(guò)降低NgR表達(dá)起作用的，目前SCI未見(jiàn)報(bào)道。所以我們通過(guò)動(dòng)

4、物實(shí)驗(yàn)研究MSCs對(duì)NgR表達(dá)的影響，初步探討MSCs是否可能通過(guò)Nogo/NgR通路來(lái)達(dá)到修復(fù)作用。
　　 目的：探討MSCs移植治療腦梗死大鼠是否可影響NgR的表達(dá)，MSCs是否可能通過(guò)Nogo/NgR通路來(lái)達(dá)到修復(fù)作用。
　　 材料與方法：
　　 1.采用貼壁分離法提取及培養(yǎng)MSCs，用流式細(xì)胞儀法鑒別MSCs，再通過(guò)多向分化誘導(dǎo)證實(shí)。
　　 2.通過(guò)大腦中動(dòng)脈電凝術(shù)(MCAO)建立大鼠腦梗死模型，

5、造模成功后將大鼠分為非移植組、3×106MSCs移植組、6×106MSCs移植組，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組作為對(duì)照組。3×106MSCs移植組和6×106MSCs移植組在造模成功24h后，分別通過(guò)靜脈注射移植3×106及6×106個(gè)第3代MSCs，移植前用Hoechst標(biāo)記MSCs。
　　 3.采用神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(NSS)評(píng)價(jià)各組神經(jīng)功能恢復(fù)狀況。
　　 4.分別于第1、2、3周取材，石蠟包埋后切片，片厚3μm，Nissl

6、染色觀察病灶周圍神經(jīng)元的存活情況，用免疫組織化學(xué)檢測(cè)病灶周圍ki67、GFAP的表達(dá)及患側(cè)室管膜下區(qū)ki67的表達(dá)，免疫組織化學(xué)及Western Blotting檢測(cè)假手術(shù)組、非移植組及MSCs移植組NgR表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.用貼壁分離法可提取到純度高、活性好的MSCs，同時(shí)可在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞及成骨樣細(xì)胞。
　　 2.MCAO術(shù)后1d，右側(cè)前肢感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及軀體感覺(jué)皮質(zhì)出現(xiàn)損害，大鼠

7、出現(xiàn)左側(cè)前肢不能完全伸直、右側(cè)感覺(jué)障礙等表現(xiàn)。MCAO術(shù)后1w、2、3w，非移植組及MSCs移植組神經(jīng)功能均可出現(xiàn)恢復(fù)，其中3×106MSCs移植組和6×106MSCs移植組兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但較非移植組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 3.與假手術(shù)組比較，MCAO術(shù)后，患側(cè)及對(duì)側(cè)大腦組織的NgR可出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，以第1周時(shí)為明顯。
　　 4.MSCs移植后1、2、3w，MSCs移植組病灶周圍的神經(jīng)元及

8、ki67較MCAO非移植組增多，同時(shí)患側(cè)室管膜下區(qū)的ki67也較非移植組增多，且6×106MSCs移植組較3×106MSCs移植組明顯。
　　 5.MSCs移植后，大腦皮質(zhì)NgR表達(dá)下降，以患側(cè)運(yùn)動(dòng)區(qū)皮質(zhì)、島葉皮質(zhì)及對(duì)側(cè)第一運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)等為主，且6×106MSCs移植組較3×106移植組下降幅度更大。
　　 7.Western Blotting顯示，MCAO術(shù)后1、2、3w，3×106MSCs移植組病側(cè)周圍的NgR表達(dá)較非移

9、植組下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠MCA皮質(zhì)支閉塞后，患側(cè)的前肢感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及軀體感覺(jué)皮質(zhì)出現(xiàn)壞死，大鼠神經(jīng)功能受損。
　　 2.MSCs可促進(jìn)MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　 3.MCAO術(shù)后，大鼠出現(xiàn)雙側(cè)大腦皮質(zhì)NgR表達(dá)增高，以第1周時(shí)為明顯，第2周后出現(xiàn)下降，但仍高于假手術(shù)組。
　　 4.MSCs移植可降低病灶周圍腦皮質(zhì)功能區(qū)及對(duì)側(cè)第一運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)的NgR表達(dá)，同