腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞再生的影響.pdf

1、背景與目的: 缺血性腦血管疾病的高致殘率嚴重影響患者的生存質(zhì)量，腦缺血損傷引起的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞和缺失是引起功能障礙的病理關(guān)鍵。針對腦缺血損傷引起的生化、代謝改變，保護神經(jīng)元免于受損，或促進腦缺血損傷后神經(jīng)細胞再生成為干預損傷、恢復功能的重要策略。目前藥物性的神經(jīng)保護研究和臨床應用仍欠理想。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)具有較強的增殖能力和多向分化潛能，可以分化為神經(jīng)元

2、、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞等神經(jīng)細胞，成為腦缺血損傷后神經(jīng)細胞再生理想的種子來源。鑒于骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導劑的毒副作用和體外分化后移植腦內(nèi)較弱的存活能力，近年來，對體外純化、擴增培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞移植腦內(nèi)以治療腦缺血損傷成為研究的熱點。因此，開展骨髓間充質(zhì)干細胞移植在神經(jīng)細胞再生和神經(jīng)功能修復方面的研究對腦缺血損傷具有重要意義。近年來漸有中醫(yī)藥在骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療腦缺血損傷的報道，但研究多集中于對其體外的誘導分化方面，所

3、選藥物以單味中藥或提取物為主，而中藥復方對BMSCs移植后在活體內(nèi)影響其存活、分化方面的研究少見。腦梗死屬中醫(yī)“中風”范疇，其病機復雜，以濁毒、血瘀和氣虛表現(xiàn)尤為突出：氣虛血瘀、毒損腦絡(luò)為腦梗死的主要病機。解毒降濁、益氣化瘀為腦梗死的主要治法。據(jù)此研制的中藥復方腦脈通(大黃川芎人參葛根)具有解毒降濁、益氣活血通絡(luò)功效，可對腦缺血損傷發(fā)揮保護作用。動物實驗和臨床觀察表明，腦脈通治療腦梗死的效果肯定，可顯著改善患者的生存質(zhì)量。鑒于上述，開展

4、中醫(yī)藥聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療腦缺血損傷研究具有重要意義。本研究從腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞再生方面評價腦脈通、BMSCs移植及其聯(lián)合的腦保護作用，并從腦脈通對BMSCs移植后腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子水平、向神經(jīng)細胞分化的比率及對促神經(jīng)元突觸重建的生長相關(guān)蛋白表達的影響方面探討其可能的作用機制。 方法: 本研究以SD大鼠為研究對象，體外全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法獲取骨髓間充質(zhì)干細胞；移植前48 h用Brdu對骨髓間充質(zhì)干細胞進行體

5、外標記；栓線阻塞大鼠大腦中動脈制備局灶性腦缺血再灌注動物模型；腦缺血3 h再灌注24 h由頸內(nèi)動脈移植骨髓間充質(zhì)干細胞懸液。動態(tài)觀察移植后早期(7 d)、中期(14 d)、后期(28 d)大鼠的神經(jīng)功能和生存狀況變化；采用病理形態(tài)學、免疫組織化學法以及免疫組織化學雙標法，從神經(jīng)功能綜合評分、腦組織含水量、腦梗塞灶、神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)變化方面觀察腦脈通對骨髓間充質(zhì)干細胞移植保護腦缺血損傷的影響；從神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標志蛋白以及與之相

6、關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的變化方面探討腦脈通聯(lián)合骨髓川充質(zhì)干細胞移植對神經(jīng)細胞的保護作用及可能的作用機制；觀察骨髓間充質(zhì)干細胞移植后在腦內(nèi)的存活、遷移和分化特點以及腦脈通對其的影響；進一步從神經(jīng)元突觸標志性蛋白表達的變化方面觀察骨髓間充質(zhì)干細胞移植后對神經(jīng)元突觸重建的作用以及腦脈通對其作用的影響。主要研究結(jié)果如下： 結(jié)論:綜合上述研究，結(jié)果提示: ①.體外全骨髓貼壁篩選純化、培養(yǎng)和擴增BMSCs的方法可行，Brdu標記BMS

7、Cs的效果理想，由頸內(nèi)動脈移植BMSCs懸液易于操作，移植后的BMSCs可在腦內(nèi)存活、遷移，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。 ②.腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能、腦組織水腫、梗塞灶大小和神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)改變可隨腦缺血再灌注時間延長有不同程度恢復；腦脈通對腦缺血再灌注損傷不同階段具有不同程度的保護作用，以早期的作用明顯；BMSCs對腦缺血再灌注損傷的保護作用與其移植后的時間相關(guān)，移植后早期未顯出明顯的腦保護作用，但隨著BMSCs移植腦

8、內(nèi)時間的延長，其保護作用逐漸增強。 ③.神經(jīng)細胞隨腦缺血再灌注損傷時間的延長持續(xù)受損、數(shù)量減少，神經(jīng)營養(yǎng)因子出現(xiàn)先增高再降低特點，其在早期的升高對神經(jīng)細胞受損具有保護作用，后期水平降低則不利于神經(jīng)細胞的再生和修復；腦脈通對神經(jīng)細胞的保護作用與其早期和中期上調(diào)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、后期上調(diào)神經(jīng)生長因子表達有關(guān)；BMSCs移植對保護神經(jīng)細胞和上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的作用隨移植后時間的延長而增強；腦脈通聯(lián)合BMSCs移植可使其對神經(jīng)細胞

9、的保護作用提前，并使后期的作用增強，以對神經(jīng)元的作用尤為明顯，這可能與腦脈通促進BMSCs移植后上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的作用有關(guān)。 ④.隨移植后時間的延長，BMSCs逐漸從血管壁通過血腦屏障進入腦實質(zhì)內(nèi)存活、向缺血側(cè)遷移，出現(xiàn)神經(jīng)細胞分化，但未顯示出分化方向的差異性；腦脈通可使移植后BMSCs在腦內(nèi)的存活增強，并在促進其向神經(jīng)細胞分化方面顯示出差異性，表現(xiàn)為促進中期BMSCs向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化和后期向神經(jīng)元細胞分化。 ⑤.

10、神經(jīng)元突觸重塑是其結(jié)構(gòu)重建與功能修復的基礎(chǔ)，神經(jīng)元突觸重塑功能隨腦缺血再灌注時間的延長有減弱趨勢，這可能與促進神經(jīng)元突觸重建生長相關(guān)蛋白的表達下調(diào)有關(guān)；腦脈通在腦缺血再灌注早期可保護神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受損，后期可增強神經(jīng)元突觸重建；BMSCs對神經(jīng)元突觸重建作用隨移植后時間的延長逐漸增強；腦脈通聯(lián)合BMSCs可使腦缺血再灌注損傷后早期神經(jīng)元突觸重建提前，并可增強中期與后期的神經(jīng)元突觸重建，其作用可能是通過上調(diào)促神經(jīng)元突觸重建的生長相關(guān)蛋白-43