抗Aβ抗體清除Aβ寡聚體后BV2細(xì)胞對SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，常呈進(jìn)行性發(fā)展，給社會造成了巨大影響。AD的病理特征是腦組織的淀粉樣斑塊沉積和神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)。目前，關(guān)于AD病因的主要假說是淀粉樣蛋白級聯(lián)假說。這一理論認(rèn)為β淀粉樣蛋白（Beta amyloid peptide Aβ），尤其是高毒性的低聚形式是促發(fā)疾病發(fā)生的主要原因。最近研究表明，Aβ1-42寡聚體(Aβ1-42oligomers)對神經(jīng)元

2、的毒性及誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)最強(qiáng)，且被認(rèn)為是AD炎癥病理生理發(fā)生發(fā)展的早期始發(fā)因子。
　　P38MAPK是分子量為38KD的多肽，存在4種亞型（α，β，γ，δ）。所有亞型都通過磷酸化Thr180/Tyr182而激活。在多種底物（激酶和轉(zhuǎn)錄因子）中借助p38依賴的絲/蘇氨酸磷酸化使p38MAPK激活可引起不同的適應(yīng)性反應(yīng)。對AD患者的大腦進(jìn)行尸檢后發(fā)現(xiàn)，磷酸化的p38MAPK的免疫活性與神經(jīng)炎性的β-淀粉樣斑塊和神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)纖維

3、纏結(jié)相關(guān)。且相關(guān)研究表明p38MAPK的激活發(fā)生在AD的超早期。進(jìn)一步研究表明，p38MAPK信號通路可通過多種途徑參與AD的病理過程，其中由p38MAPK介導(dǎo)的免疫炎癥機(jī)制參與了AD病理的發(fā)生發(fā)展過程。研究表明，Aβ1-42寡聚體可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞中的p38MAPK通路，釋放炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等從而引起神經(jīng)元的損傷。
　　AD的免疫治療旨在清除患者腦內(nèi)的Aβ，從而阻止神經(jīng)退行性變的進(jìn)展。一些主動和被動免疫

4、方法正在臨床試驗(yàn)階段。然而，有臨床研究顯示，用抗Aβ抗體清除Aβ后AD患者的認(rèn)知及腦脊液中tau蛋白水平并沒有改善，且某些免疫治療甚至可引起腦膜腦炎及血管性水腫等不良反應(yīng)。
　　本實(shí)驗(yàn)研究抗Aβ1-42抗體清除Aβ1-42寡聚體后預(yù)處理的BV2細(xì)胞對SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制，觀察清除Aβ后神經(jīng)退行性變是否繼續(xù)存在及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：用2umol/LAβ1-42寡聚體作用于BV2細(xì)胞為激活組，加入2umol/LA

5、β1-42寡聚體6h后加入12ul抗Aβ1-42抗體清除Aβ1-42為抗體組，對照組為加入等量的生理鹽水，各組培養(yǎng)24h。將各組收集的條件培養(yǎng)液作用于SH-SY5Y細(xì)胞，培養(yǎng)24h。1、MTT法檢測神經(jīng)細(xì)胞活力:將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后更換上述收集的3組條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。每孔加入5g/L MTT溶液20ul，37度孵育4h后，加入DMSO150ul并振蕩15min，于570nm波長處測定各孔A570值，并

6、計(jì)算細(xì)胞存活率。2、用ELISA法檢測BV2細(xì)胞上清液中TNF-α水平。3、Western印跡法檢測磷酸化p38MAPK的表達(dá)情況。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，認(rèn)為p＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、MTT法檢測細(xì)胞活力:與對照組相比，Aβ1-42寡聚體激活組和抗體組分別作用于神經(jīng)細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率明顯下降，分別為（61.65±3.04）％和（13.55±3.04）％，抗體組的神經(jīng)細(xì)胞存

7、活率明顯低于Aβ1-42寡聚體激活組(p＜0.01)。
　　2、ELISA法檢測BV2細(xì)胞上清液中TNF-α水平:與對照組相比，Aβ1-42寡聚體激活組和抗體組均可引起TNF-α的釋放，且水平明顯高于對照組(p＜0.05)。而Aβ1-42寡聚體激活組和抗體組引起的TNF-α升高水平相當(dāng)，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、Western印跡法檢測磷酸化p38MAPK的表達(dá)情況:Aβ1-42寡聚體可以誘導(dǎo)磷酸化p38MAPK的表達(dá)且作