幾種中藥活性成分對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)等是嚴(yán)重危害人類健康的一類神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativediseases，NDD)，是由腦中特定區(qū)域神經(jīng)元發(fā)生退變而引起的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來，NDD發(fā)病率急劇上升，特別是在老齡化人口中。由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，因此

2、迄今尚無理想的防治藥物問世。導(dǎo)致NDD發(fā)生的確切的病理生理學(xué)機(jī)理尚未明確，目前認(rèn)為由多種原因引起，并提出了多種假說，其中代表性的有神經(jīng)遞質(zhì)失衡學(xué)說，氧化應(yīng)激學(xué)說、線粒體功能障礙學(xué)說、興奮性神經(jīng)毒性學(xué)說、異常蛋白聚積學(xué)說、基因突變、炎癥過程、免疫異常及細(xì)胞凋亡學(xué)說等。近年來越來越多的資料證明，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激與其他幾種機(jī)制相互作用，氧化應(yīng)激和線粒體參與可能是主要的觸發(fā)因素。細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactiveoxygenspecies

3、，ROS)在各種細(xì)胞內(nèi)不斷產(chǎn)生和清除，當(dāng)體內(nèi)氧化水平超過了抗氧化作用時(shí)，氧化應(yīng)激就會(huì)發(fā)生。ROS在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中扮演了重要角色，參與多種生理和病理過程。
　　 過氧化氫(H2O2)是體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，同時(shí)也是一種ROS，在誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷乃至死亡中起了關(guān)鍵作用。H2O2造成的細(xì)胞氧化損傷已成為研究神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的重要工具之一。
　　 赤芍和土木香均為臨床中常用的藥物。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血

4、、化瘀止痛、消腫通經(jīng)等功效。土木香是菊科植物土木香InulaheleniumL.或藏木香InularacemosaHook.f.的干燥根，廣泛分布于歐洲中南部和亞洲的喜馬拉雅山脈，具有多種藥理作用，具有祛痰、止咳等作用，常被用于治療多種呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，赤芍對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，文獻(xiàn)報(bào)道赤芍對(duì)于PD、AD等NDD的治療具有一定的作用，但涉及其中的分子機(jī)制有待深入系統(tǒng)的研究。ROS在許多疾病包括神經(jīng)退行性疾病的發(fā)

5、生、發(fā)展中扮演了重要角色，我們推斷具有增加細(xì)胞抗氧化能力、具有抑制ROS對(duì)細(xì)胞損傷的藥物可能有助于NDD的防治，所以探討具有清除ROS和具有神經(jīng)保護(hù)潛能的天然物質(zhì)對(duì)細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用和機(jī)制的研究具有重要意義。赤芍和土木香具有抗氧化作用，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)赤芍和土木香具有清除DPPH自由基、羥自由基等活性，我們推斷赤芍對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用和赤芍的抗氧化特性有關(guān)，赤芍發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制可能與清除ROS和阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路有關(guān)。目前認(rèn)

6、為線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是三個(gè)主要的凋亡信號(hào)通路，caspase3是這些凋亡信號(hào)通路的執(zhí)行者。
　　 關(guān)于土木香總黃酮對(duì)SH-SY5Y氧化應(yīng)激損傷的影響未見相關(guān)報(bào)道。黃酮類化合物是一類次生代謝產(chǎn)物廣泛分布在不同植物中，具有各種生物活性如抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎等;也有助于預(yù)防心血管疾病和抗血小板聚集。
　　 基于以上研究背景，本研究以H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡為模型，探討赤芍相關(guān)的三種活性單體芍藥

7、苷(paeoniflorin，PF)、沒食子酸(gallicacid，GA)和赤芍801(propylgallate，PG)對(duì)H2O2引起的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷和凋亡的影響及其機(jī)制。具體內(nèi)容如下:
　　 1.H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型的建立
　　 目的:建立H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型。
　　 方法:不同濃度H2O2(12.5、25.0、50.0、100、200

8、、400、800、1600、3200、6400μmol·L-1)作用SH-SY5Y細(xì)胞不同時(shí)間(1、2、4、8、12、24小時(shí))誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷，通過相差顯微鏡觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變化，利用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率，篩選H2O2致SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的劑量;Heochest33258染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征;AnnexinV-FITC/PI雙染，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;碘化丙啶(propidiumio

9、dide，PI)染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期構(gòu)成比;硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化的INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl-tetrazoliumchloride)顯色反應(yīng)檢測(cè)乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase，LDH)釋放量，2'，7'-Dichlorofluoresceindiacetate(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS);ELISA(Enzyme-linkedImmu

10、noSorbentAssay)方法檢測(cè)8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）;JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrialmembranepotential，MMP);Fura-2AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度;利用caspase3可以催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)的反應(yīng)檢測(cè)caspase3活性;應(yīng)用c

11、aspase9催化特異性底物acetyl-Leu-Glu-His-Aspp-nitroanilide(Ac-LEHD-pNA)檢測(cè)caspase9活性。
　　 結(jié)果:過氧化氫組與正常對(duì)照組相比，H2O2劑量依賴、時(shí)間依賴地造成SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷。相對(duì)于正常組，終濃度為200μmol·L-1H2O2作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力下降為65％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01），細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.01）;明顯出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形

12、態(tài)學(xué)特征;增殖指數(shù)(proliferationindex，PI％)降低(P＜0.05);8-OHdG含量上升(P＜0.01);LDH釋放量和細(xì)胞內(nèi)ROS增加(P＜0.01），線粒體膜電位下降(P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升(P＜0.01），caspase3和caspase9活性增強(qiáng)(P＜0.01）。
　　 結(jié)論:200μmol·L-1H2O2作用細(xì)胞24h，細(xì)胞活力顯著下降，明顯造成細(xì)胞氧化損傷，造模成功。
　　

13、2.沒食子酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制研究
　　 目的:以H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷為模型，探討沒食子酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制。
　　 方法:篩選沒食子酸(gallicacid，GA)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無毒劑量范圍，以此劑量范圍研究沒食子酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制。將細(xì)胞分為5組。正常對(duì)照組（Control），H2O2

14、模型組(Model),GA5μmol·L-1組(GA1)、GA10μmol·L-1組（GA2）、GA25μmol·L-1組(GA3)。GA組先加入GA預(yù)處理1h后再加入終濃度為200μmol·L-1H2O2。Heochest33258染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征;AnnexinV-FITC/PI雙染，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期構(gòu)成比;diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)檢測(cè)LDH釋放量;DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞

15、內(nèi)ROS;ELISA法檢測(cè)8-OHdG;JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位;Fura-2AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度;利用caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA的反應(yīng)檢測(cè)caspase3活性;應(yīng)用caspase9催化特異性底物Ac-LEHD-pNA檢測(cè)caspase9活性。
　　 結(jié)果:過氧化氫組與正常對(duì)照組相比，終濃度為200μmol·L-1H2O2作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力下降為65％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.

16、01)，細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.01）;明顯出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征;增殖指數(shù)(proliferationindex，PI％)降低(P＜0.05);8-OHdG含量上升(P＜0.01）;LDH釋放量和細(xì)胞內(nèi)ROS增加(P＜0.01），線粒體膜電位下降(P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升(P＜0.01），caspase3和caspase9活性增強(qiáng)(P＜0.01）。與H2O2損傷組相比，終濃度為5-25μmol·L-1GA能顯著改善上述

17、指標(biāo)的變化(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:GA在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SYSY神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)效應(yīng)可能與清除ROS，減輕DNA氧化損傷，抑制線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 3.芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制研究
　　 目的:以H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷為模型，探討芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制。

18、>　　 方法:篩選芍藥苷(paeoniflorin，PF)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無毒劑量范圍，以此劑量范圍研究芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制。將細(xì)胞分為5組。正常對(duì)照組(Control)，H2O2模型組(Model),PF10μmol·L-1組(PF1)、PF20μmol·L-1組(PF2)、PF40μmol·L-1組(PF3)。PF組先加入PF預(yù)處理1h后再加入終濃度為200μmol·L-1H2O2。He

19、ochest33258染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征;AnnexinV-FITC/PI雙染，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期構(gòu)成比;diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)檢測(cè)LDH釋放量;DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS;ELISA法檢測(cè)8-OHdG;JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位;Fura-2AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度;利用caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA的反應(yīng)檢測(cè)caspase3活性;應(yīng)用c

20、aspase9催化特異性底物Ac-LEHD-pNA檢測(cè)caspase9活性。
　　 結(jié)果:過氧化氫組與正常對(duì)照組相比，終濃度為200μmol·L-1H2O2作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力下降為65％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.01）;明顯出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征;增殖指數(shù)(proliferationindex，PI％)降低(P＜0.05);8-OHdG含量上升(P＜0.01);LDH釋放量和細(xì)胞內(nèi)RO

21、S增加(P＜0.01），線粒體膜電位下降(P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升（P＜0.01），caspase3和caspase9活性增強(qiáng)（P＜0.01）。與H2O2損傷組相比，2O-40μmol·L-1PF能顯著改善過氧化氫誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的改變(P＜0.05）;終濃度10μmol·L-1pF組與H2O2組相比PI％無顯著變化(P＞0.05)，LDH和8-OHdG含量無顯著變化(P＞0.05)，但能顯著改善過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)

22、特征，提高過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降(P＜0.05），抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS上升(P＜0.05），抑制線粒體膜電位的下降（P＜0.05），抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高(P＜0.05），抑制caspase3和caspase9活性增強(qiáng)(P＜0.05)，減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率的上升(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:PF在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SYSY神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)效應(yīng)可能與清除ROS，減輕DN

23、A氧化損傷，抑制線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 4.赤芍801對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制研究
　　 目的:以H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷為模型，探討赤芍801對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制。
　　 方法:篩選赤芍801(propylgallate，PG)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無毒劑量范圍，以此劑量范圍研究赤芍801對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧

24、化損傷的影響及其機(jī)制。將細(xì)胞分為5組。正常對(duì)照組（Control），H2O2模型組(Model)，PG20μmol·L-1組(PG1)、PG40μmol·L-1組(PG2)、PG80μmol·L-1組(PG3)。PG組先加入PG預(yù)處理1h后再加入終濃度為200μmol·L-1H2O2。Heochest33258染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征;AnnexinV-FITC/PI雙染，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期構(gòu)成比;d

25、iaphorase催化的INT顯色反應(yīng)檢測(cè)LDH釋放量;DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS;ELISA法檢測(cè)8-OHdG;JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位;Fura-2AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度;利用caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA的反應(yīng)檢測(cè)caspase3活性;應(yīng)用caspase9催化特異性底物Ac-LEHD-pNA檢測(cè)caspase9活性。
　　 結(jié)果:過氧化氫組與正常對(duì)照組相比，終濃度為200μmol·

26、L-1H2O2作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力下降為65％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.01）;明顯出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征;增殖指數(shù)(proliferationindex，PI％)降低(P＜0.05);8-OHdG含量上升(P＜0.01);LDH釋放量和細(xì)胞內(nèi)ROS增加(P＜0.01），線粒體膜電位下降(P＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升(P＜0.01），caspase3和caspase9活性增強(qiáng)(P＜0.0

27、1）。與H2O2損傷組相比，40-80μmol·L-1PG均能顯著改善過氧化氫誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的改變(P＜0.05）;終濃度20μmol·L-1PG組與H2O2組相比PI％無顯著變化(P＞0.05)，LDH和8-OHdG含量無顯著變化(P＞0.05)，但能顯著改善過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，提高過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降（P＜0.05），抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS上升(P＜0.05），抑制線粒體膜電位的下降(P＜0.05），抑制細(xì)胞

28、內(nèi)鈣離子濃度的升高(P＜0.05），抑制caspase3和caspase9活性增強(qiáng)(P＜0.05），減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率的上升(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:PG在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SYSY神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)效應(yīng)可能與清除ROS，減輕DNA氧化損傷，抑制線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 5.土木香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制研究
　　

29、 目的:以H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷為模型，探討土木香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響。
　　 方法:篩選土木香總黃酮(totalflavonoids，TF)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無毒劑量范圍，以此劑量范圍研究土木香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制。將細(xì)胞分為5組。正常對(duì)照組（Control），H2O2模型組(Model)，TF5mg·L-1組(TF1)、TF10mg·

30、L-1組（TF2）、TF20mg·L-1組（TF3）。TF組先加入TF預(yù)處理1h后再加入終濃度為200μmol·L-1H2O2。DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。
　　 結(jié)果:過氧化氫組與正常對(duì)照組相比，終濃度為200μmol·L-1H2O2作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力顯著下降(P＜0.01）;與H2O2損傷組相比，5-20mg·L-1TF能顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡(P＜0.05)，抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS上升(P＜0.05）。<