透骨消痛膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞周期與凋亡影響的研究.pdf

1、目的：
　　 探討透骨消痛膠囊含藥血清影響軟骨細(xì)胞周期與凋亡的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.新西蘭大白兔60只,抽簽法隨機(jī)分為空白組(0.9％生理鹽水灌胃)、對照組(壯骨關(guān)節(jié)丸5mg/ml溶液灌胃)、實驗1組(透骨消痛膠囊2.5mg/ml溶液灌胃)、實驗2組(透骨消痛膠囊5mg/ml溶液灌胃)、實驗3組(透骨消痛膠囊10mg/ml溶液灌胃),20ml/次,2次/天,連續(xù)3天,腹主動脈采血,制備含藥血清。

2、r>　　 2.新西蘭大白兔32只,取膝關(guān)節(jié)軟骨建立體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞,甲苯胺藍(lán)染色、RT-PCR檢測CollageⅡ mRNA鑒定。第3代軟骨細(xì)胞同步化,抽簽法隨機(jī)分為空白組、對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組,分別加入含15％各組血清DMEM培養(yǎng)24h、48h、72h,MTT檢測軟骨細(xì)胞的活性,流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞周期的分布,確定含藥血清的有效干預(yù)時間。第3代軟骨細(xì)胞同步化,抽簽法隨機(jī)分組分別加入含15％各組血清DMEM培養(yǎng)72

3、h,熒光倒置相差顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞CyclinD1、CDK4、p21 mRNA表達(dá)。
　　 3.第3代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h,抽簽法隨機(jī)分為凋亡1組(SNP終濃度0mmol/L)、凋亡2組(SNP終濃度0.5mmol/L)、凋亡3組(SNP終濃度1mmol/L)、凋亡4組(SNP終濃度2mmol/L)干預(yù)24h,熒光倒置相差顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),Hocehst3

4、3342染色鑒定軟骨細(xì)胞的凋亡,MTT檢測軟骨細(xì)胞的活性,確定SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系。
　　 4.第3代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h,抽簽法隨機(jī)分為空白組、對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組,分別加入含SNP終濃度為1mmol/L15％各組血清DMEM培養(yǎng)12h、24h、36h,MITT檢測軟骨細(xì)胞的活性,確定含藥血清的有效干預(yù)時間。第3代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h,抽簽法隨機(jī)分組分別加入含SNP終濃度為1mmol/L15％各組血清D

5、MEM培養(yǎng)24h,MTT檢測軟骨細(xì)胞的活性,Hocehst33342染色檢測軟骨細(xì)胞的凋亡率,熒光倒置相差顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),Annexin V-FITC/PI檢測軟骨細(xì)胞的早期凋亡,RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞p53、Bcl-2 mRNA表達(dá),比色法檢測軟骨細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.原代、第2代、第3代軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色,胞漿內(nèi)呈紫紅色異染顆粒

6、；原代、第2代、第3代、第4代、第5代軟骨細(xì)胞CollageⅡ mRNA表達(dá)逐漸降低,原代、第2代、第3代明顯高于第4代、第5代(P<0.01)。透骨消痛膠囊含藥血清促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的有效作用濃度為15％,有效作用時間為72h；干預(yù)72h,軟骨細(xì)胞的表型穩(wěn)定；軟骨細(xì)胞OD值,對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)；軟骨細(xì)胞CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá),對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)

7、；軟骨細(xì)胞p21mRNA表達(dá),對照組、實驗2組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)。
　　 2.干預(yù)24h,SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的有效作用濃度為1mmol/L。透骨消痛膠囊含藥血清抑制軟骨細(xì)胞凋亡的有效作用時間為24h；干預(yù)24h,軟骨細(xì)胞OD值,對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)；軟骨細(xì)胞的凋亡率,對照組、實驗2組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)；軟骨細(xì)胞p53 mRNA表達(dá),對照組、實驗2

8、組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)；軟骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá),對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)；軟骨細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,對照組、實驗2組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.透骨消痛膠囊含藥血清能上調(diào)軟骨細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)因子CyclinD1、CDK4表達(dá),下調(diào)負(fù)向調(diào)節(jié)因子p21表達(dá),加速軟骨細(xì)胞周期關(guān)鍵限制點G1/S期的