透骨消痛膠囊含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞活性與線粒體凋亡通路及細(xì)胞外基質(zhì)的影響.pdf

1、目的:
　　 探討透骨消痛膠囊含藥血清影響軟骨細(xì)胞活性與線粒體凋亡通路及細(xì)胞外基質(zhì)的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.清潔級(jí)4周齡SD大鼠50只,抽簽法隨機(jī)分為5組,即:空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組,每組各10只。分別給予相對(duì)應(yīng)的給藥量灌胃3d,腹主動(dòng)脈采血,制備透骨消痛膠囊含藥血清。
　　 2.清潔級(jí)4周齡SD大鼠20只,取膝關(guān)節(jié)軟骨建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫

2、組化染色鑒定軟骨細(xì)胞,MTT法繪制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,選取理想的種子細(xì)胞。第3代軟骨細(xì)胞同步化,分別加入含10％空白組、實(shí)驗(yàn)2組的血清DMEM培養(yǎng)24h、48h、72h、96h,MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞活性,確定含藥血清的有效干預(yù)時(shí)間;第3代軟骨細(xì)胞同步化,分別加入含5％、10％、15％、20％的空白組、實(shí)驗(yàn)2組的血清DMEM培養(yǎng)72h,MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞活性,確定含藥血清的有效干預(yù)濃度。
　　 3.第3代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h,抽簽法

3、隨機(jī)分為凋亡1組、凋亡2組、凋亡3組、凋亡4組,干預(yù)24h,熒光倒置相差顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),Hocehst33342染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞的凋亡率,確定SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系。第3代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h,分別加入含SNP終濃度為1mmol/L10％空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組的血清DMEM干預(yù)24h,MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞活性,Realtime RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-9、C

4、aspase-3 mRNA基因表達(dá)。
　　 4.第3代軟骨細(xì)胞同步化,分別加入含10％空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組的血清DMEM干預(yù)72h,MTT法觀察軟骨細(xì)胞的增殖;免疫組化染色分析軟骨細(xì)胞基質(zhì)中Ⅱ型膠原的表達(dá),Realtime RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞基質(zhì)中CollagenⅡ、PG、Aggrecan、CathepsinK mRNA基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代、第2代、第3代軟骨細(xì)胞

5、生長(zhǎng)狀況良好,甲苯胺藍(lán)染色,胞漿內(nèi)見紫紅色異染顆粒,Ⅱ型膠原免疫組化染色,胞漿被染成棕黃色,胞核不著色;至第4代,軟骨細(xì)胞發(fā)生梭形變,軟骨細(xì)胞特有表型開始丟失。增殖曲線上,第2、3代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,活性比第4、5代軟骨細(xì)胞高,尤其是第3代軟骨細(xì)胞。
　　 2.透骨消痛膠囊含藥血清干預(yù)后,軟骨細(xì)胞OD值,干預(yù)72h明顯高于干預(yù)24h、48h、96h(P＜0.05);10％含藥血清濃度組明顯高于5％、20％含藥血清濃度組(P＜0.

6、01)。確定72h為有效作用時(shí)間,10％為有效作用濃度。
　　 3.干預(yù)24h,SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的有效作用濃度為1mmol/L;含藥血清干預(yù)24h,軟骨細(xì)胞OD值,對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組明顯高于空白組(P＜0.05);軟骨細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá),對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組明顯高于空白組(P＜0.05);軟骨細(xì)胞Bax、Caspase-9、Caspase-3mRNA表達(dá),對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組明顯低于空白組(P＜0.01)。
　　

7、 4.在10％含藥血清濃度的作用下干預(yù)72h,第3代軟骨細(xì)胞OD值,透骨消痛膠囊實(shí)驗(yàn)組明顯高于空白組(P＜0.01),實(shí)驗(yàn)2組增殖效果最明顯(P＜0.05);Ⅱ型膠原免疫組化染色,透骨消痛膠囊實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原表達(dá)強(qiáng)于空白組及對(duì)照組;CollagenⅡ、PG、AggrecanmRNA基因表達(dá),透骨消痛膠囊實(shí)驗(yàn)組明顯升高(P＜0.01),其中實(shí)驗(yàn)2組升高最顯著(P＜0.01);CathepsinKmRNA基因表達(dá),透骨消痛膠囊實(shí)驗(yàn)組明顯降低

8、(P＜0.01),其中實(shí)驗(yàn)2組降低最顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.透骨消痛膠囊含藥血清干預(yù)軟骨細(xì)胞活性的有效作用時(shí)間為72h,有效作用濃度為10％。
　　 2.透骨消痛膠囊含藥血清能加速軟骨細(xì)胞增殖,維持軟骨細(xì)胞活性,其促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖與藥物濃度有關(guān),以中劑量藥物濃度(含透骨消痛膠囊29mg/d)為最佳。
　　 3.透骨消痛膠囊含藥血清能下調(diào)軟骨細(xì)胞促凋亡基因Bax、Caspase-9、