透骨消痛膠囊對TNF-α抑制成骨細胞增殖、分化的干預(yù)作用研究.pdf

1、目的:
　　 研究透骨消痛膠囊對TNF-α抑制成骨細胞增殖、分化的干預(yù)作用，探討藥物對成骨細胞成骨功能的調(diào)節(jié)作用，以利于深入研究透骨消痛膠囊對骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨骨重建的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 1透骨消痛膠囊對TNF-α抑制成骨細胞增殖的干預(yù)實驗
　　 1.1采用MTT法篩選藥物干預(yù)的最佳條件。
　　 1.2實驗分組:據(jù)篩選的藥物干預(yù)濃度，分正常對照組、TNF-α組、TNF-α+藥物（低、中、

2、高）組。
　　 1.3指標(biāo)檢測
　　 (1) MTT檢測各組細胞的OD值。
　　 (2)形態(tài)學(xué)觀察:①倒置顯微鏡觀察，比較正常組、TNF-α組、藥物組顯微形態(tài)變化;②PI/Hoechst雙染激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，比較各組細胞死亡率;③透射電鏡觀察各組細胞超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 2透骨消痛膠囊對TNF-α抑制成骨細胞分化的干預(yù)實驗
　　 2.1實驗分組:分成正常對照組、TNF-α組、TNF-α+藥

3、物組。
　　 2.2指標(biāo)檢測
　　 (1)堿性磷酸酶（AKP）活性與骨鈣素(OCN)含量:分別取藥物干預(yù)后2、4、6、8、10、12、14天細胞上清，生化分析AKP活性、ELISA檢測OCN含量。
　　 (2)特殊染色觀察礦化結(jié)節(jié):①茜素紅染色，光鏡觀察各組礦化結(jié)節(jié)的形成情況;②四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，比較各組礦化結(jié)節(jié)的形成情況。
　　 (3)掃描電鏡觀察礦化結(jié)節(jié)及原位定量分析Ca元素:

4、①掃描電鏡觀察礦化結(jié)節(jié)及鈣質(zhì)分泌，比較各組的礦化結(jié)節(jié);②采用能譜分析儀對礦化結(jié)節(jié)進行Ca元素原位定量分析，比較各組在200倍、相同面積下Ca元素含量;并在5000倍下比較各組單細胞及其周圍的Ca元素含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.透骨消痛膠囊對TNF-α抑制成骨細胞增殖的干預(yù)作用
　　 1.1藥物干預(yù)最佳條件的選擇:藥物1.25mg/ml時細胞的OD值最高;在該劑量下藥物干預(yù)24h時細胞增值率最大。
　　

5、 1.2細胞增殖的MTT檢測:與TNF-α組比較，各藥物組的OD值較大，并以中劑量組(1.25mg/ml)最大，提示了藥物可降低TNF-α對成骨細胞增殖的抑制作用。
　　 1.3細胞增殖的倒置顯微鏡觀察:TNF-α組細胞胞體變小、收縮，多數(shù)細胞變圓、漂浮，細胞大量死亡;各藥物組細胞形態(tài)明顯改善，以中劑量組(1.25mg/ml)細胞狀態(tài)最好，說明了藥物對成骨細胞增殖的保護作用。
　　 1.4成骨細胞死亡率的激光共聚焦顯微鏡

6、觀察與分析:TNF-α組細胞死亡率達55.07％，而藥物組細胞死亡率明顯減少為18.68％，說明了藥物對細胞生長的保護作用。
　　 1.5成骨細胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察:TNF-α組多數(shù)細胞核內(nèi)異染色質(zhì)聚集，核膜鼓起，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、核糖體脫落，線粒體固縮，提示這些細胞已變性、壞死;部分細胞收縮，核染色質(zhì)高度凝聚，核碎裂，細胞凋亡;而藥物組多數(shù)細胞的細胞核、細胞質(zhì)等細胞器明顯改善。這些提示了藥物對TNF-α誘導(dǎo)成骨細胞損傷的改善作用

7、。
　　 2.透骨消痛膠囊對TNF-α抑制成骨細胞分化的干預(yù)作用
　　 2.1成骨細胞分化早期標(biāo)志（AKP活性）、分化晚期標(biāo)志（OCN含量）的檢測:與TNF-α組比較，藥物作用2天后，就可促進AKP活性、OCN含量的升高，6天后其促進作用更明顯，提示了藥物可促進成骨細胞早、晚期分化，并可降低TNF-α對成骨細胞分化的抑制作用。
　　 2.2成骨細胞分化成熟標(biāo)志（礦化結(jié)節(jié)）的特殊染色觀察:茜素紅與四環(huán)素染色均發(fā)現(xiàn)結(jié)

8、果顯示，TNF-α組未形成礦化結(jié)節(jié)，而藥物組可形成礦化結(jié)節(jié)，說明藥物可促進成骨細胞分化成熟。
　　 2.3礦化結(jié)節(jié)的掃描電鏡觀察及其Ca元素的原位定量分析:掃描電鏡下，TNF-α組無礦化結(jié)節(jié)，而藥物組可見礦化結(jié)節(jié)。通過Ca元素原位定量的能譜分析顯示，藥物組的Ca元素?zé)o論在低倍或在高倍（單細胞及其周圍）中均較TNF-α組高。這進一步說明藥物可促進成骨細胞鈣質(zhì)分泌。
　　 結(jié)論:
　　 1.透骨消痛膠囊能促進成骨細胞