紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉對肝癌的藥效學(xué)及作用機(jī)制研究.pdf

1、肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，90％以上是肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)。近幾十年來，我國HCC的治療盡管取得了長足的進(jìn)步，手術(shù)切除率、術(shù)后生存率及生存質(zhì)量均有較大提高，但與其他腫瘤相比，HCC的療效遠(yuǎn)未如人意。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程，其具體的發(fā)病機(jī)制仍不是十分清楚，肝癌臨床生物學(xué)行為較惡、預(yù)后極差，其早期肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后早期復(fù)發(fā)的特性直接影響治療方法的選擇及患者

2、的生存質(zhì)量和生存時(shí)間。近年來，伴隨著納米分子醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展、腫瘤發(fā)生機(jī)制的闡明及新的腫瘤治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)等，新型抗腫瘤藥物的開發(fā)以及治療手段的創(chuàng)新和綜合運(yùn)用都取得了令人可喜的成果。在眾多抗腫瘤藥中，植物單體類抗腫瘤藥所占的比重仍然較大，植物單體類抗腫瘤藥物紫杉醇和多西他賽足以說明植物單體類抗腫瘤藥物在目前腫瘤治療中的重要作用。
　　目的：隨著放、化療藥物的毒副作用等問題愈顯突出，新型高效低毒抗腫瘤藥物的研發(fā)日益受

3、到人們的關(guān)注。目前，大環(huán)內(nèi)酯類藥物在非感染性疾病中的作用研究日趨活躍。紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉是利用聲膜分離技術(shù)從天然植物大血藤中提取的單體物質(zhì)，經(jīng)成鹽反應(yīng)得到紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸納（Sargentgloryvinestempolyterpenemacrolideacidsodium，SPMA），其分子式為C38H46O8Na。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該藥物對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。因此，我們擬通過對紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉的

4、體內(nèi)外藥效學(xué)及一般毒理學(xué)研究，明確其抗腫瘤作用及機(jī)制，為其進(jìn)一步的臨床前研究奠定理論基礎(chǔ)，也為獲得一種新型的高效低毒的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：（1）應(yīng)用不同濃度的紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉作用于肝癌細(xì)胞HepG-2和HHCC，通過對細(xì)胞生長曲線測定、細(xì)胞周期檢測、凋亡檢測以及荷瘤裸鼠抑瘤試驗(yàn)等，明確紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉的藥效學(xué)。（2）應(yīng)用高通量基因表達(dá)譜芯片檢測藥物作用前后基因差異表達(dá)情況，通過對差異表達(dá)基

5、因所在通路的分析，篩選出紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞生長的主要通路，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。（3）針對上述篩選出的通路，通過基因轉(zhuǎn)染、基因干涉等技術(shù)進(jìn)行各種分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉通過該通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，明確其抗腫瘤作用的靶點(diǎn)。（4）通過對單次給藥前后的SD大鼠血壓和心率的監(jiān)測、連續(xù)給藥一個(gè)月的SD大鼠的血常規(guī)和血清各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測以及連續(xù)給藥大鼠主要臟器的組織切

6、片HE染色觀察，明確紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉在有效抑瘤作用的劑量下是否對機(jī)體主要臟器功能造成影響，是否會產(chǎn)生明顯的全身毒副作用。
　　結(jié)果：（1）紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉能顯著影響肝癌細(xì)胞的生長狀態(tài)、抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且具有一定的時(shí)間和劑量依賴性，但對正常人單個(gè)核細(xì)胞PBMCs未見明顯生長抑制作用。此外，紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉能阻滯細(xì)胞周期于S期，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG-2及HHCC凋亡。體內(nèi)荷瘤動物實(shí)驗(yàn)顯示紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉能顯著縮小

7、荷瘤鼠的移植瘤體積，并且主要器官的組織切片HE染色未見明顯的病理學(xué)變化。（2）通過基因表達(dá)譜分析，藥物作用肝癌細(xì)胞HepG-2后，差異表達(dá)基因共計(jì)有4349個(gè)，通過對顯著差異表達(dá)基因相關(guān)通路的Pathway分析，篩選出了兩條紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路：一條為內(nèi)源性線粒體途徑：bcl-2—線粒體—CeytC—caspase9凋亡通路；另一條為Skp2介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯誘導(dǎo)的凋亡途徑。（3）紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉

8、可下調(diào)bcl-xl和mcl-1基因表達(dá)，上調(diào)bak基因的表達(dá)并引起胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白的聚積。（4）通過Skp2干涉載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Skp2表達(dá)后，藥物對細(xì)胞的增殖抑制作用明顯降低，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。（5）連續(xù)給藥一個(gè)月（每3天一次）后，受試SD大鼠的血常規(guī)及各項(xiàng)主要生化指標(biāo)均在其參考區(qū)間范圍內(nèi)，各主要臟器的組織切片HE染色也未見明顯的病理學(xué)變化。
　　結(jié)論：（1）體內(nèi)外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉能顯著抑

9、制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且在有效治療劑量范圍內(nèi)未見對機(jī)體產(chǎn)生明顯的毒副作用。（2）紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉能通過下調(diào)bcl-2家族中的抑凋亡基因bcl-xl和mcl-1的表達(dá)并上調(diào)該家族促凋亡基因bak的表達(dá)，進(jìn)而激活內(nèi)源性線粒體凋亡通路，引起細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)一步激活caspase9而引起肝癌細(xì)胞凋亡。（3）紅藤四萜大環(huán)內(nèi)酯酸鈉可同時(shí)以S期激酶相關(guān)蛋白Skp2為靶點(diǎn)，引起細(xì)胞阻滯于S期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。（4）治療劑量的紅藤四萜大環(huán)