ErmB導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在臨床廣泛應(yīng)用，主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染，而細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。甲基化酶erm基因是導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯高水平耐藥的重要機(jī)制之一。文獻(xiàn)認(rèn)為erm催化23S rRNA2058位腺嘌呤核苷酸的修飾，使其單甲基化或二甲基化。甲基化后的空間結(jié)構(gòu)使細(xì)菌與大環(huán)內(nèi)酯的結(jié)合位點(diǎn)被隱藏，阻斷了大環(huán)內(nèi)酯等抗生素與細(xì)菌核糖體之間的結(jié)合，從而導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯、林可酰胺及鏈霉殺陽菌素耐藥。但是erm甲基化作用機(jī)制及其對細(xì)菌耐藥程度的貢獻(xiàn)

2、在國際國內(nèi)尚未見報道。
　　本實(shí)驗(yàn)室于臨床發(fā)病雛鴨腦和脾臟中分離的解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種(S.gallolyticus subsp.pasteurianus)中發(fā)現(xiàn)耐藥基因ermB和ermT,且這兩種erm基因介導(dǎo)這些分離株大環(huán)內(nèi)酯高水平耐藥。此外，我們還發(fā)現(xiàn)不同分離株中ermB單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）引起ermB突變，且其大環(huán)內(nèi)酯MIC存在差異。為了探討erm甲基化

3、作用機(jī)制及其對大環(huán)內(nèi)酯耐藥的貢獻(xiàn)，本研究優(yōu)化了ermB和ermT表達(dá)體系，選取了ermB進(jìn)行研究，并基于生物信息學(xué)分析及臨床分離株中的SNP構(gòu)建了32種ermB突變體，首次利用微量稀釋法對這32種突變體進(jìn)行篩選，選取了六個突變體，分別檢測了它們對23S rRNA的甲基化活性和對大環(huán)內(nèi)酯及林可酰胺的最小抑菌濃度(MIC)。研究結(jié)果如下:
　　1、ermB、ermT甲基化酶表達(dá)載體的構(gòu)建與純化及23S rRNA的分離純化
　　將

4、ermT耐藥基因分別構(gòu)建到pET28a、pET15b載體上，ermB耐藥基因分別構(gòu)建到pET21b、 pET28a載體上，比較蛋白分離純化結(jié)果，選擇ermB、ermT構(gòu)建至pET28a載體的克隆，利用親和層析純化出ErmB、ErmT蛋白、MBP-MS2蛋白以及S.gallolyticus subsp.pasteurianus23S rRNA。
　　2、ermB、ermT的甲基化活性比較
　　用3H標(biāo)記S-腺苷甲硫氨酸為甲基供

5、體，23S rRNA為底物，對ErmB、ErmT進(jìn)行酶促動力學(xué)試驗(yàn)。兩個蛋白的甲基化活性通過液閃儀檢測轉(zhuǎn)移到23S rRNA上3H的放射性強(qiáng)度完成。試驗(yàn)結(jié)果表明，ErmB和ErmT均可以甲基化修飾S.gallolyticussubsp.pasteurianus23S rRNA，但ermB甲基化活性要低于ermT。
　　3、ermB突變體構(gòu)建
　　結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期解沒食子酸鏈球菌分離株中ermB的SNP，我們選取ermB進(jìn)行研究

6、。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析erm及ermB同源序列，對ermB保守區(qū)域部分氨基酸殘基進(jìn)行突變，構(gòu)建了32個突變體。
　　4、ermB、ermB突變體MIC值檢測粗篩
　　對ermB及其32個突變體進(jìn)行MIC值檢測。結(jié)果表明，與野生型ermB的MIC值相比，32株突變體中對紅霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A);對林可酰胺MIC降低的突變體包括:突

7、變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、116-1(E116A)、139(R139A);對克拉霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株58-1(ES8A)、58-2(E58D)、60-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)。
　　5、微量稀釋法測定6株突變體的MIC值
　　通過ermB、ermB突變體MIC值檢測粗篩選擇6株ermB突變體進(jìn)行精確MIC值檢測，檢測結(jié)果顯示，突變菌株

8、83-1(D83A)對紅霉素、克拉霉素、林可酰胺的MIC值分別為:512μg/mL、64μg/mL、512μg/mL;突變菌株139139(R139A)對三種抗生素的MIC值分別為:512μg/mL、64μg/mL、128μg/mL;突變菌株165165(K165A)對三種抗生素的MIC值分別為:1024μg/mL、128μg/mL、128μg/mL;突變菌株4040(K40A)對三種抗生素的MIC值分別為512μg/mL、128μg/

9、mL、256μg/mL;突變菌株37(G37A)對三種抗生素的MIC值分別為:1024μg/mL、256μg/mL、512μg/mL;突變菌株39(G39A)對三種抗生素的MIC值分別為:1024μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL。
　　6、ermB及ermB突變體甲基化活性比較
　　用3H標(biāo)記S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，23S rRNA為底物，對野生型及突變體ErmB的甲基化活性進(jìn)行檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，突變體

10、37(G37A)、39(G39A)酶活性高于野生型ermB甲基化酶活性，突變體40(K40A)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)酶活性小于野生型ermB甲基化酶活性。
　　7、ermB甲基化酶生物進(jìn)化樹構(gòu)建
　　利用Mrbays3.1.2生物信息學(xué)軟件對ermB不同物種進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建了ermB甲基化酶的系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　結(jié)論:ermB、ermT基因構(gòu)建到pET28a載體上蛋白純化效

11、果較好。構(gòu)建的32個ermB突變體與野生型ermB的MIC值相比，對紅霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A);對林可酰胺MIC降低的突變體包括:突變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、116-1(E116A)、139(R139A);對克拉霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株58-1(E58A)、58-2(E58D)、60-2(E69D)、83-1(D

12、83A)、139(R139A)、165(K165A)。
　　突變菌株37(G37A)、39(G39A)獲得的酶活性大于野生型ermB，突變菌株40(K40A)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)獲得的酶活性小于野生型ermB，與MIC值變化趨勢相符。以上結(jié)果說明，氨基酸K40、D83、R139及K165對ermB甲基化活性具有重要作用，這些氨基酸殘基進(jìn)一步影響大環(huán)內(nèi)酯耐藥。本研究為揭示大環(huán)內(nèi)酯耐藥機(jī)制