肌球蛋白輕鏈激酶CaM結(jié)合位點(diǎn)突變體的構(gòu)建、表達(dá)及功能研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)利用牛胃重組全長(zhǎng)野生型MLCK，對(duì)其1002-1022氨基酸(即CaM結(jié)合位點(diǎn))進(jìn)行定點(diǎn)突變，使牛胃MLCK cDNA序列中的T3016、G3017、A3052、G3053、A3054、C3055、T3056 突變?yōu)镚3016、C3017、G3052、C3053、G3054、G3055、C3056，在氨基酸水平上Trp1006、Arg1018、Leu1019將被突變?yōu)锳la。并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功地進(jìn)行了大量表達(dá)，經(jīng)純化獲得了

2、重組的MLCK突變體。檢測(cè)了重組MLCK突變體對(duì)肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影響、MLCK突變體與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合的活性以及對(duì)體外肌絲運(yùn)動(dòng)的影響，進(jìn)一步證明了MLCK的非激酶活性在平滑肌收縮過程中的調(diào)節(jié)作用。 方法：根據(jù)牛胃重組全長(zhǎng)野生型MLCK的cDNA序列設(shè)計(jì)兩條突變引物，通過PCR反應(yīng)進(jìn)行定點(diǎn)突變。在大腸桿菌中表達(dá)重組全長(zhǎng)野生型MLCK(WT/MLCK)和CaM結(jié)合位點(diǎn)突變型MLCK(△CaM/MLCK)，通過親和層析

3、及凝膠過濾進(jìn)行分離純化。SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)及純化的重組蛋白。Glycerol-PAGE檢測(cè)重組MLCK對(duì)MLC20的磷酸化水平?？兹妇G方法檢測(cè)重組MLCK突變體對(duì)肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影響。蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ca2+/CaM對(duì)重組MLCK與肌動(dòng)蛋白結(jié)合活性的影響。體外肌絲運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)(in vitro motility assay)檢測(cè)重組MLCK對(duì)肌動(dòng)蛋白肌絲運(yùn)動(dòng)速度的影響。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)論：1.通過定點(diǎn)

4、突變獲得重組MLCK鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)突變體(△CaM/MLCK)并可以在大腸桿菌中以可溶形式大量表達(dá)；經(jīng)親和層析和凝膠過濾獲得較純的重組MLCK。2.△CaM/MLCK失去了磷酸化肌球蛋白20KD調(diào)節(jié)輕鏈的激酶活性。3.通過重組突變型MLCK(△CaM/MLCK)對(duì)肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影響表明MLCK具有非激酶活性。在無Ca2+/CaM條件下，激活非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性；抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP