MLCK鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)突變體的構(gòu)建及其對(duì)VSMC增殖和遷移的影響.pdf

1、目的:平滑肌在體內(nèi)分布廣泛，其具有多種獨(dú)特的功能和復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)維持人體生理功能起重要的調(diào)節(jié)作用。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chainkianse，MLCK)是調(diào)節(jié)平滑肌收縮的關(guān)鍵酶。一般情況下，當(dāng)平滑肌細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高并達(dá)到閾值，Ca2+和鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合物，該復(fù)合物可以激活MLCK，活化的MLCK可以使肌球蛋白20kDa調(diào)節(jié)輕鏈（myo

2、sin light chains，MLC20）的第19位絲氨酸磷酸化，進(jìn)而激活肌球蛋白頭部的Mg2+-ATP酶的活性，ATP水解釋放能量，促使肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間發(fā)生相互作用，引起平滑肌的收縮，這是平滑肌收縮的激酶調(diào)節(jié)機(jī)制。MLCK作為一種多功能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，除具有激酶活性外，還具有與肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白結(jié)合的非激酶活性。研究表明，MLCK對(duì)細(xì)胞增殖、遷移以及細(xì)胞骨架的重組也有重要的作用。在生理?xiàng)l件下，平滑肌細(xì)胞在Ca2+濃度下降后仍維持

3、一定程度張力，表明MLCK的非激酶作用可能在平滑肌收縮與舒張的調(diào)節(jié)過(guò)程中產(chǎn)生一定影響。以往的體外功能研究顯示:當(dāng)MLCK的第1002-1022位CaM結(jié)合位點(diǎn)突變后，MLCK失去了磷酸化MLC20的激酶活性;并且它可以在無(wú)Ca2+/CaM條件下降低磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性，增加非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性;同時(shí)它也可以降低體外肌動(dòng)蛋白肌絲運(yùn)動(dòng)的速度。為了更好地研究MLCK分子的非激酶活性對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷

4、移的影響，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建MLCK的CaM結(jié)合位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體。利用牛胃重組全長(zhǎng)野生型MLCK，對(duì)其第1002-1022位氨基酸（即CaM結(jié)合位點(diǎn)）進(jìn)行定點(diǎn)突變。本實(shí)驗(yàn)在牛胃平滑肌MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)Trp1006突變?yōu)锳la的基礎(chǔ)上進(jìn)行突變，使MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)中Arg1018突變?yōu)锳la（即AGA突變?yōu)镚CG）、Leu1019突變?yōu)锳la（即CTG中的CT突變?yōu)镚C），從而構(gòu)建了牛胃ML

5、CK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)突變的真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。為了研究MLCK的非激酶活性對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響，將構(gòu)建的MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體(pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM)轉(zhuǎn)染至MLCK基因缺失的豚鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(Gba M-)，對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖和遷移的變化。本實(shí)驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上，為探索MLCK的非激

6、酶活性對(duì)平滑肌細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步闡明平滑肌收縮的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:(1)根據(jù)牛胃MLCK cDNA序列設(shè)計(jì)CaM結(jié)合位點(diǎn)突變引物，利用PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建CaM結(jié)合位點(diǎn)突變的原核表達(dá)載體(pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM)和真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。(2)將pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-細(xì)胞，用免疫熒光法檢測(cè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染情況。(3

7、)用合適濃度的G418篩選pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Gba M-的細(xì)胞株。(4)用MTT法檢測(cè)pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-后細(xì)胞增殖情況。(5)用劃痕法檢測(cè)pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-后細(xì)胞遷移情況。
　　結(jié)果:(1)針對(duì)CaM結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物，以pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM為模板進(jìn)行PCR，用NcoⅠ單酶切pCo

8、ldⅠ-MLCK-Δ1CaM質(zhì)粒和pColdⅠ-MLCK質(zhì)粒，分別從pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM獲得556bp突變的目的片段，從pColdⅠ-MLCK獲得7.4kb的載體片段，用連接酶將556bp突變目的片段和7.4kb載體片段連接，獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)三點(diǎn)突變的原核表達(dá)載體pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確。(2)用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-M

9、LCK真核表達(dá)質(zhì)粒，分別從pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM獲得3.4kb目的片段，從pcDNA3.1-Flag-MLCK獲得5.5kb的載體片段，用連接酶將3.4kb目的片段和5.5kb的載體片段連接獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)三點(diǎn)突變的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確。(3)用免疫熒光法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染情況，將pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48小時(shí)

10、后的Gba M-細(xì)胞充分表達(dá)MLCK蛋白，轉(zhuǎn)染效率約達(dá)80％。(4)利用G418篩選質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Gba M-的細(xì)胞株，確定了G418對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MLCK基因缺失型Gba SM-4的藥物最低致死濃度為500 ug/ml。(5)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示:與Gba SM-4細(xì)胞(未敲除MLCK)組相比，Gba M-（MLCK敲除）組細(xì)胞增殖率明顯升高;而分別將pcDNA3.1-

11、Flag-MLCK和pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染到Gba M-后細(xì)胞增殖率均明顯降低，但二者未見(jiàn)顯著差異(p＞0.05)。(6)用劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移，結(jié)果顯示:與Gba SM-4組相比，Gba M-組細(xì)胞遷移率降低，而分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-MLCK和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM到GbaM-后細(xì)胞遷移率均升高，但二者未見(jiàn)明顯差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)成功的構(gòu)