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文檔簡介
1、自上世紀(jì)初,人們提出利用病毒治療腫瘤以來,病毒開始廣泛地應(yīng)用于腫瘤治療。目前腺病毒成為腫瘤基因治療中研究最多,應(yīng)用最廣泛的病毒載體,原因在于其具有以下特點(diǎn):宿主范圍廣泛,可感染處于分裂和非分裂期的細(xì)胞,不整合入染色體基因組,無插入致突變性,易操作,易純化,致病性低且病毒滴度高等。然而腺病毒在腫瘤治療中也存在一些問題,如靶向性差,某些細(xì)胞中感染效率低等。因此,人們開始對腺病毒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行以下改造:特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變,某基因片段的缺失突變及在上
2、述兩種方法基礎(chǔ)上腫瘤治療基因的插入等。至今,人們對腺病毒的結(jié)構(gòu)和功能有了較深的認(rèn)識,但是這大多集中在保守區(qū)的研究上,如腺病毒早期基因EIA的保守區(qū)CR1、CR2和CR3,而對保守區(qū)之間的非保守區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能及其對保守區(qū)的影響了解較少。
為此本研究對EIA進(jìn)行缺失突變,并研究突變EIA能否與Rb結(jié)合,及該腺病毒突變體對腫瘤細(xì)胞生長的影響。將編碼腺病毒E1A蛋白111-120位氨基酸殘基的核苷酸缺失突變,并在該基因上游插入綠色
3、熒光蛋白報(bào)告基因構(gòu)建增殖型腺病毒載體AdSUEGFP-EIA△111-120。同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的野生型腺病毒AdSUEIA和缺失與Rb結(jié)合能力的突變腺病毒T100(缺失EIA上125-128位的nt)作為對照。這些腺病毒載體的EIA均受人端粒酶啟動子(hTERTp)的調(diào)控,可在端粒酶陽性的細(xì)胞中表達(dá)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示AdSUEGFP-EIA△111-120可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所攜帶的外源基因,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測到突變E1A具有與
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