Her2siRNA腺病毒載體的構(gòu)建及其對卵巢癌細(xì)胞生長抑制作用.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,由于其起病隱匿，缺乏早期診斷的指標(biāo)和有效的治療手段，死亡率高居婦科惡性腫瘤榜首。而且近年來卵巢癌的發(fā)病比率呈上升趨勢，因此探索腫瘤治療的新方法在臨床上具有重要意義。
　　Her2基因是人類表皮生長因子受體2(Human Epidermal Growth Factor Receptor-type2)的編碼基因，所編碼的蛋白為185kD，是一種跨膜受體糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性。研究表明Her

2、2過表達(dá)可以增加細(xì)胞的增殖、生長、細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移，引起血管內(nèi)皮生長因子和網(wǎng)織紅細(xì)胞增加及血管生成，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。該基因是人類腫瘤中發(fā)生改變頻率最高的癌基因之一。在許多上皮來源的惡性腫瘤如乳腺癌、上皮性卵巢癌、肺癌組織等有研究顯示均存在Her2表達(dá)過高，因此Her2基因被認(rèn)為是上皮細(xì)胞起源的腫瘤治療的有效靶點之一。研究表明針對Her2胞外區(qū)的人源化單克隆抗體Herceptin對腫瘤細(xì)胞的生長有一定的抑制作用，用于晚期乳腺癌的治療已經(jīng)

3、取得了顯著療效。
　　本實驗以Her2原癌基因為靶標(biāo)，Her2高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3作為靶細(xì)胞，利用基因重組方法，構(gòu)建其siRNA的重組腺病毒。通過含有腺病毒E1的HEK293細(xì)胞包裝，獲得高滴度的重組腺病毒。病毒感染卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3后通過檢測Her2蛋白的表達(dá)觀察Her2基因的沉默效果，同時觀察該重組腺病毒對細(xì)胞的生長抑制作用。為進(jìn)一步研究Her2基因功能及其下游調(diào)節(jié)基因提供實驗基礎(chǔ)，有望為卵巢癌基因治療提供一

4、種選擇手段。
　　目的：
　　1.針對Her2基因構(gòu)建siRNA腺病毒表達(dá)載體；
　　2.觀察腺病毒介導(dǎo)的Her2siRNA對卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的生長抑制作用；
　　3.檢測重組腺病毒對腫瘤抗原Her2表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.根據(jù)Her2基因mRNA選取兩個siRNA作用位點并設(shè)計合成寡核苷酸，克隆入pSuppressor構(gòu)建siRNA表達(dá)載體(Her2aRNAi-pSuppressor

5、、Her2bRNAi-pSuppressor)；
　　2.利用MluⅠ和HindШ雙酶切將所需的U6啟動子和Her2siRNA克隆入經(jīng)MluⅠ和EcoRⅠ雙酶切的穿梭載體pShuttle中，得到Her2asiRNA/pShuttle和Her2bsiRNA/pShuttle；
　　3.Her2asiRNA/pShuttle、Her2bsiRNA/pShuttle通過基因重組方法將表達(dá)siRNA所需的元件與腺病毒DNA相連，用P

6、CR和酶切鑒定方法進(jìn)行篩選和鑒定，獲得重組腺病毒Adeno-Her2aRNAi和Adeno-Her2bRNAi，并進(jìn)一步在293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增得到高滴度的重組腺病毒；
　　4.利用得到的重組腺病毒感染卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3，采用WesternBlot法檢測感染前后Her2蛋白表達(dá)水平的變化；
　　5.利用細(xì)胞Proliferation法測定病毒感染后對卵巢癌SKOV-3細(xì)胞系生長的影響。
　　結(jié)果：
　　1.

7、成功構(gòu)建表皮生長因子受體2(Her2)siRNA的腺病毒表達(dá)載體(Adeno-X-lacZ為空載體)，滴度達(dá)108-1010pfu/mL。該重組腺病毒表達(dá)載體經(jīng)Odessey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析顯著抑制SKOV-3細(xì)胞中Her2的蛋白表達(dá)水平(p<0.01)，光密度掃描測定的結(jié)果顯示Adeno-Her2aRNAi組72h降低70％，Adeno-Her2bRNAi組48h、72h分別降低50％和80％(以0h的Her2表達(dá)量為100％

8、)；
　　2.細(xì)胞增殖曲線顯示重組腺病毒可明顯抑制SKOV-3細(xì)胞的生長(p<0.05)，與空載體組比，Adeno-Her2aRNAi和Adeno-Her2bRNAi組在MOI為25，72h時的增殖抑制率分別為12％、15％；在MOI為50，72h時的增殖抑制率分別為31％、38％；在MOI為100，72h時的增殖抑制率分別為47％、48％。因此Adeno-Her2bRNAi組比Adeno-Her2aRNAi組抑制效應(yīng)更好。