Compound3對人卵巢癌細胞SKOV3生長抑制作用及凋亡作用的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 誘導惡性腫瘤細胞的凋亡和增強化療藥物的敏感性是治療卵巢癌的重要方向。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，包括兩種死亡途徑，即死亡受體途徑與線粒體途徑。死亡受體途徑又稱外源性凋亡途徑，是通過死亡配體與其細胞膜上的相應的受體結(jié)合，然后通過DISC的形成以激活caspase8/10，并最終激活caspase 3啟動細胞凋亡。線粒體通路又稱內(nèi)源性凋亡途徑，是線粒體接受外界凋亡刺激信號后釋放細胞色素C至細胞漿中，細胞色素C與凋

2、亡蛋白酶激活因子
　　 1、caspase9及ATP等相互作用導致凋亡小體的形成，進而激活caspase 3從而誘發(fā)凋亡。
　　 Smac是一種線粒體蛋白，在凋亡刺激信號下，與細胞色素C一起自線粒體釋放入細胞胞漿內(nèi)，通過其N端的四個氨基酸殘基AVPI結(jié)構(gòu)域，與IAPs家族中的各個蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而IAPs正是通過該結(jié)構(gòu)域與caspase家族結(jié)合以抑制caspase的凋亡作用，從而發(fā)揮抑制凋亡作用。因此，Smac蛋

3、白能夠使IAPs喪失與caspase的結(jié)合能力，促進IAPs的降解，從而使caspase能夠發(fā)揮凋亡作用。IAPs是化療藥物促凋亡過程中的關鍵蛋白，決定了化療敏感性及耐受性，因此IAPs成為治療惡性腫瘤的新靶點，IAPs的抑制蛋白Smac蛋白也成為治療惡性腫瘤的新方法。為此，很多Smac蛋白的模擬物問世。Smac蛋白的模擬物有多聚核苷酸，Smac多肽，Smac小分子三種。其中Smac小分子為一種小分子化合物，因其具有較強細胞膜穿透作用、

4、代謝周期長、生物利用度較高等優(yōu)點而成為目前研究的熱點。
　　 2004年美國德克薩斯大學西南醫(yī)學中心根據(jù)Smac蛋白的N端功能結(jié)構(gòu)域設計合成了一種具有Smac蛋白生物學活性的Smac蛋白模擬物，命名為Smac小分子compound 3。順鉑是卵巢癌治療的一線化療藥物之一，其主要作用機制是作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，能夠與DNA形成復合物從而干擾DNA的復制，并且能夠與核蛋白或者胞漿蛋白結(jié)合，損害細胞膜結(jié)構(gòu)，干擾細胞的生理功能，最

5、終引起細胞凋亡。
　　 研究目的：
　　 通過檢測compound 3與順鉑作用于人卵巢癌細胞SKOV3后的生長抑制作用、細胞凋亡作用及XIAP、caspase3的表達，探討compound 3對人卵巢癌細胞SKOV3對順鉑的敏感性的影響。
　　 材料與方法：
　　 材料:人卵巢癌細胞SKOV3來源于上海中國科學院細胞庫。順鉑購買于山東齊魯制藥公司。compound3為2004年美國德克薩斯大學西南醫(yī)學中

6、心實驗室根據(jù)Smac蛋白的N端的氨基酸序列AVPI結(jié)構(gòu)域合成的一類具有Smac蛋白生物學活性的小分子化合物。
　　 方法:人卵巢癌細胞SKOV3培養(yǎng)至細胞成對數(shù)生長時，進行實驗分組，如下:陰性對照組（培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)）、compound3組（compound3的應用濃度為100nmol/L的濃度，是美國德克薩斯大學西南醫(yī)學中心實驗室推薦濃度）、順鉑組（順鉑的應用濃度為4mg/L，是實驗前通過進行MTT測得的順鉑作用于人卵巢癌細胞S

7、KOV348h的LC50）、compound3+順鉑組（compound3的應用濃度為100nmol/L的濃度，順鉑的應用濃度為4mg/L）。MTT法檢測各組人卵巢癌細胞SKOV3的存活率、生長抑制率并根據(jù)存活率繪制生長曲線。AnnexinV-FITC/PI雙標流式細胞術檢測人卵巢癌細胞SKOV3的凋亡率。Westernblot蛋白印跡檢測人卵巢癌細胞SKOV3的XIAP、caspase3的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1

8、.compound3對人卵巢癌細胞SKOV3的存活率的影響及繪制生長曲線:順鉑作用于人卵巢癌細胞SKOV312、24、48h后的存活率分別為(96.38±2.0)％、(88.50±1.38)％、(45.78±0.66)％。compound3作用于SKOV312、24、48h后的存活率分別為(98.67±0.88)％、(89.88±0.39)％、(64.18±0.92)％。compound3+順鉑作用于SKOV312、24、48h后的存活

9、率分別為(92.2±0.99)％、(53.59±1.17)％、(25.56±0.6)％。Compoud3、順鉑均能使SKOV3的存活率降低。compound3+順鉑作用于SKOV312、24、48h后存活率降低較順鉑及compound3作用于SKOV3后的存活率降低更加明顯。根據(jù)存活率繪制的生長曲線顯示三組存活率均隨作用時間延長而降低，具有時間依賴性。
　　 2.compound3對人卵巢癌細胞SKOV3的生長抑制作用:comp

10、ound3+順鉑、順鉑作用于SKOV324h后的生長抑制率分別為(46.4±1.17)％、(11.5±1.38)％;48h后的生長抑制率分別為(74.03±0.6)％、(54.22±0.66)％。compound3+順鉑作用于SKOV324、48h后的生長抑制率比順鉑作用于SKOV324、48h后的生長抑制率均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。Compound3能夠增強順鉑對人卵巢癌細胞SKOV3的生長抑制作用。
　　 3.comp

11、ound3對人卵巢癌細胞SKOV3的細胞凋亡作用:compound3+順鉑作用于SKOV324h后的凋亡率為(28.32±1.09)％;順鉑、compound3作用于SKOV324h的凋亡率分別為(20.8±2.09)％、(19.44±1.89)％。compound3+順鉑作用于SKOV348h后的凋亡率為(84.48±0.98)％;順鉑、compound3作用于SKOV348h后的凋亡率分別為(54.4±1.32)％、(23.59±2

12、.04)％。compound3+順鉑作用于SKOV324、48h的凋亡率均明顯高于順鉑及compound3作用于SKOV324、48h的凋亡率，差異具有統(tǒng)計學意義。Compound3能夠促進順鉑對卵巢癌細胞SKOV3的細胞凋亡作用。
　　 4.compound3對人卵巢癌細胞SKOV3的XIAP及caspase-3的表達的影響:compound3+順鉑作用于卵巢癌細胞SKOV324、48h后，測得XIAP的表達逐漸減低，并存在時

13、間依賴關系。compound3及compound3+順鉑作用于SKOV324、48h后XIAP表達均降低。compound3+順鉑作用于SKOV324、48h后的caspase3的激活片段與順鉑、compound3作用與SKOV324、48h后的caspase3的激活片段相比，表達明顯增高。Compound3能夠使XIAP表達降低，聯(lián)合順鉑應用時能夠使caspase3激活片段表達升高。
　　 結(jié)論及意義：
　　 1.co