蝎毒多肽提取物對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和死亡率有緩慢上升趨勢。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中卵巢癌發(fā)病率已從第三位上升到第二位，由于大部分患者就診時(shí)已是臨床晚期，其死亡率更是高居各類婦科腫瘤的首位。目前，卵巢惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的輔助性化療，五年生存率僅為20％～25％左右，對女性生命仍存在嚴(yán)重威脅，如何控制卵巢癌的發(fā)展以及尋找新的治療方法，已成為目前重點(diǎn)研究課題。
　　 腫瘤

2、內(nèi)部及周圍的血管生成被認(rèn)為是其增殖、轉(zhuǎn)移的前提，因此，抑制腫瘤血管生成對于控制腫瘤進(jìn)展、改善預(yù)后和提高患者生存率具有十分重要的意義。中醫(yī)治療腫瘤病癥有著悠久的歷史，蝎毒作為一種傳統(tǒng)中藥己被應(yīng)用于多種疾病的治療，它的抗腫瘤作用也受到越來越多的重視。蝎毒多肽是從東亞鉗蝎蝎毒中提取的一種多肽組分，本研究組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)解毒多肽對肝癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤具有抗血管生成及抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的作用，但目前蝎毒多肽對卵巢癌的具體作用及機(jī)制研究較少。

3、因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測蝎毒多肽對卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用、對細(xì)胞周期影響以及血管生成過程中關(guān)鍵因子的表達(dá)，進(jìn)一步探討蝎毒多肽抑制人卵巢癌細(xì)胞的可能作用機(jī)制。
　　 目的:
　　 觀察蝎毒多肽提取物(PESV)對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用和對細(xì)胞周期的影響，以及PESV干預(yù)后SKOV3細(xì)胞中VEGF、TSP-1、Id-1蛋白及mRNA表達(dá)水平變化，揭示PESV抗腫瘤作用機(jī)制，為PESV抗癌作用提供新的理論依據(jù)。

4、r>　　 方法:
　　 1.采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT實(shí)驗(yàn)檢測解毒多肽對SKOV3細(xì)胞形態(tài)以及增殖活性
　　 的影響。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測蝎毒多肽對SKOV3細(xì)胞周期分布的影響。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法及Westembolt測定PESV干預(yù)后SKOV3細(xì)胞中VEGF、TSP-I、
　　 Id-l蛋白表達(dá)變化。4.RT-PCR檢測蝎毒多肽對SKOV3細(xì)胞中VEGF-A、TSP-1、Id-l

5、基因mRNA的表達(dá)
　　 的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.蝎毒多肽對SKOV3細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響
　　 對照組細(xì)胞形態(tài)呈短梭形、多邊形，細(xì)胞大小均勻一致，胞漿豐富透亮，細(xì)胞貼壁良好，生長旺盛。與對照組相比，PESV作用48h后細(xì)胞密度減少，細(xì)胞變圓且胞內(nèi)顆粒感增強(qiáng)，貼壁差，細(xì)胞脫落呈漂浮狀，隨著藥物濃度加大，上述現(xiàn)象更加明顯。
　　 2.MTT檢測蝎毒多肽對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用
　　

6、 蝎毒多肽12.5～200μg/mL對SKOV3細(xì)胞均有增殖抑制作用，并隨著濃度的增加抑制作用逐漸加強(qiáng)。PESV質(zhì)量濃度為50、100、200μg/mL時(shí)，抑制率分別為38.78％、53.30％、79.22％，作用顯著且呈質(zhì)量濃度相關(guān)性，各劑量組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.蝎毒多肽對SKOV3細(xì)胞周期的影響
　　 隨PESV濃度升高，Go/G1期細(xì)胞所占比例由對照組的45.80％±1.05逐漸增高

7、至69.28％±1.03，S期細(xì)胞比例由對照組的32.50％±0.98逐漸下降至17.23％±0.31，各組間比較P＜O.OI。PESV對細(xì)胞周期的影響呈質(zhì)量濃度效應(yīng)關(guān)系。
　　 4.蝎毒多肽對SKOV3細(xì)胞VEGF、TSP-1、Id-1蛋白表達(dá)的影響
　　 4.1免疫細(xì)胞化學(xué)法蝎毒多肽作用SKOV3細(xì)胞48h后，VEGF、Id-1表達(dá)較對照組明顯下調(diào)(P＜0.01)，且VEGF表達(dá)與Id-1呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.819

8、，P＜0.01;TSP-1表達(dá)上調(diào)，150μg/mL組呈強(qiáng)陽性(P＜0.01)，I00μg/mL組呈陽性(P＜0.05),50pg/mL組與對照組相比差異不顯著。
　　 4.2Westemblot法蝎毒多肽100、150μg/mL組VEGF表達(dá)減少(P＜0.01)，Id-1在各劑量組表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.01)。TSP-1蛋白表達(dá)量隨PESV濃度升高而增加，150μg/mL組相對于對照組明顯增強(qiáng)（P<0.01）。統(tǒng)計(jì)分析得出，

9、Id-1與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.762，P＜0.01，與TSP-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，r=-0.741，P＜0.01。
　　 5.蝎毒多肽對SKOV3細(xì)胞中VEGF、TSP-1、Id-1mRNA表達(dá)的影響
　　 隨PESV濃度增加，細(xì)胞中VEGF與Id-1mRNA表達(dá)呈下降趨勢，而TSP-1mRNA則表達(dá)上調(diào)。與對照組相比，150μg/mL組VEGF與Id-lmRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，TSP-1表達(dá)