三氧化二銻對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3增殖抑制的研究.pdf

1、目的： 卵巢癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的健康。由于缺乏有效的早期診斷的方法，70％的卵巢癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，卵巢癌也是死亡率最高的婦科惡性腫瘤。其主要的死亡原因在于復(fù)發(fā)和包括順鉑在內(nèi)的化療藥耐藥，在現(xiàn)有的治療手段下五年存活率未見(jiàn)明顯增高，且長(zhǎng)期化療導(dǎo)致病人耐藥或毒副作用的發(fā)生。因此，尋找新的更有效的藥物以進(jìn)一步提高卵巢癌患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量是非常必要的。銻劑應(yīng)用于人類，歷史悠久，主要用于治療寄生蟲(chóng)病。上世

2、紀(jì)60年代初期進(jìn)行篩選合成抗癌化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)數(shù)種銻類化合物有抗癌活性。但一直未進(jìn)行深入的研究。近年來(lái)關(guān)于銻類化合物的抗癌活性重新引起人們的重視。有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)微摩爾濃度的銻劑(三氧化二銻)能顯著抑制白血病細(xì)胞、惡性淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)，而對(duì)正常的淋巴細(xì)胞無(wú)影響，其機(jī)理為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。于文強(qiáng)等通過(guò)研究不同銻劑對(duì)早幼粒細(xì)胞白血病凋亡誘導(dǎo)作用比較發(fā)現(xiàn)三價(jià)銻劑能夠有效地誘導(dǎo)早幼粒白血病細(xì)胞凋亡，提示Sb<,2>O<,3>等三價(jià)銻劑在未來(lái)的抗癌作用方面有

3、廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)用三氧化二銻作用于體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，初步探討三氧化二銻的作用效果，為其用于卵巢癌的治療提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。 方法： 1三氧化二銻溶液的配制三氧化二銻溶于稀鹽酸中制成1.1mmol/L的貯備液，4℃閉光保存。臨用前攪拌至少30min，以含10％FBS RPM11640培養(yǎng)基分別稀釋至25～6.25μmol/L，保存三氧化二銻最多不超過(guò)3天。2細(xì)胞

4、培養(yǎng)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3按照相應(yīng)的濃度加入96孔板培養(yǎng)板于5％CO<,2>、97％濕度、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，設(shè)置空白對(duì)照組、高、中、低濃度組，每組加入等量培養(yǎng)液、不同濃度的三氧化二銻溶液。分別培養(yǎng)24、48、72h。3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡、Giemsa染色和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。4 DNALadder測(cè)定提取細(xì)胞DNA，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤細(xì)胞發(fā)生的DNA降解。5流式細(xì)胞分析采用

5、流式細(xì)胞儀定量分析經(jīng)不同濃度三氧化二銻作用于卵巢癌細(xì)胞的凋亡率及其細(xì)胞周期特異性和蛋白bcl-2、bax的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，描繪生長(zhǎng)柱狀圖可知經(jīng)不同濃度三氧化二銻處理后的SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，明顯的生長(zhǎng)抑制，并呈作用濃度和時(shí)間依賴性。而空白對(duì)照組細(xì)胞則生長(zhǎng)正常2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡觀察，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞透明，密度較大，呈復(fù)層性生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較少，細(xì)胞核隱

6、約可見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞顆粒較多，細(xì)胞間隙模糊，飄浮細(xì)胞數(shù)量增加，存活細(xì)胞顯著減少。經(jīng)Giemsa染色后進(jìn)行光鏡觀察，可見(jiàn)到細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)明顯的改變。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞核染色均勻，核仁清晰可見(jiàn)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮，變圓，核仁染色不均，核染色質(zhì)邊聚，但未見(jiàn)凋亡小體。提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。透射電鏡觀察到空白對(duì)照組和不同濃度三氧化二銻對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變分別如下：空白對(duì)照組的

7、正常腫瘤細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞形態(tài)呈多邊形，核質(zhì)比例失調(diào)，核大不規(guī)則，常染色質(zhì)豐富異染色質(zhì)少，核中央有一大而圓的核仁，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞表面的微絨毛減少；低濃度三氧化二銻實(shí)驗(yàn)組的凋亡腫瘤細(xì)胞形態(tài)為細(xì)胞形態(tài)更加不規(guī)則，細(xì)胞膜皺縮，線粒體嵴部分融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有顆粒融合或脫顆?，F(xiàn)象，核膜局部向外突起，核染色質(zhì)濃縮，體積縮小，電子密度增加，邊聚于核膜下，厚薄不均，有的形成半月；中濃度三氧化二銻實(shí)驗(yàn)組的凋亡腫瘤細(xì)胞形態(tài)除上

8、述表現(xiàn)外，同時(shí)出現(xiàn)核濃縮，體積縮小，電子密度增高，部分核膜破碎形成核碎片；高濃度三氧化二銻實(shí)驗(yàn)組的凋亡腫瘤細(xì)胞形態(tài)為部分核膜外層溶解、消失，線粒體嵴大部分融合消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒現(xiàn)象嚴(yán)重，核碎裂呈兩大片，但未見(jiàn)典型的凋亡小體。提示三氧化二銻對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)凋亡作用，且隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變?cè)矫黠@。3細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況。4 DNA Ladder測(cè)定提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞

9、DNA，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞DNA出現(xiàn)凋亡的特征性改變，即DNA呈梯度樣降解并隨作用濃度的增大，梯度樣條帶逐漸明顯。而對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)凋亡的特征性改變。5細(xì)胞凋亡率變化流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明與對(duì)照組相比，不同濃度三氧化二銻實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率升高明顯(P<0.01)，細(xì)胞周期的改變實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比隨著藥物濃度的增加，G<,0>/G<,1>期和S期細(xì)胞逐漸減少(P<0.01)，而G<,2>/M期細(xì)胞逐漸增加(P<0.0

10、1)。6 bcl-2與bax蛋白表達(dá)量經(jīng)不同濃度的三氧化二銻作用48h后，bcl-2蛋白表達(dá)量減少，bax蛋白表達(dá)量增加(P<0.01)。 結(jié)論： 1三氧化二銻能抑制體外培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈時(shí)間和劑量依賴性。2三氧化二銻能誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)凋亡可能為其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制之一。3細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)bax蛋白表達(dá)有關(guān)，這可能是其誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡的途徑之一。4本研究