SiRNA靶向Her-2基因?qū)β殉舶┘?xì)胞株SKOV3生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、背景:盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但是卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率仍居高不下。人類基因組圖譜的繪制以及人類基因組研究的蓬勃興起，為從源頭上防治惡性腫瘤提供了新的途徑。近期的大量研究表明，人類基因組中與細(xì)胞增殖分化相關(guān)癌基因的激活和抑癌基因的失活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)了對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行基因治療的理論和實(shí)踐探索。尋找和確定有治療意義的目的基因是實(shí)施腫瘤基因治療的前提。RNA干擾(RNA interfefing,R

2、NAi)是一種由長約21-23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子(double-stranded RNA，dsRNA)引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，以序列特異的方式抑制同源基因的表達(dá)，其副作用小，特異性高。RNAi是生物界普遍存在的一種調(diào)控基因表達(dá)的有效方式和鑒定基因功能的重要手段，具有高效特異阻斷基因表達(dá)的特點(diǎn)，在基因功能研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究以及基因治療中得到廣泛的應(yīng)用。近年來，小分子干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)

3、在腫瘤基因治療方面取得了重大進(jìn)展。通過向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入能穩(wěn)定表達(dá)siRNA分子的質(zhì)?；虿《据d體來研究特定癌基因或抑癌基因的功能。 Her-2基因又稱C-erbB-2，其編碼的蛋白產(chǎn)物p185該蛋白產(chǎn)物在人類腫瘤中因基因擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄異常而導(dǎo)致過度表達(dá)，是表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor，EGFR)亞群的成員之一，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、分化起著重要的作用，且與腫瘤的化療敏感性呈顯著的負(fù)相關(guān)。

4、我們?cè)O(shè)想通過RNAi在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞中Her-2表達(dá)水平的調(diào)控，觀察該方法對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特征的影響，從而為將來該方法在臨床上的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的: 探討利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的siRNA能否有效的介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，觀察其對(duì)Her-2基因表達(dá)的抑制作用和對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3生物學(xué)行為的影響。 方法: ①設(shè)計(jì)、構(gòu)建及鑒定Her-2/siRNA、Her-2/siRN

5、A-negative重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。 ②Her-2/siRNA、Her-2/siRNA-negative重組載體在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到包裝病毒細(xì)胞株P(guān)T67中，嘌呤霉素篩選并挑選細(xì)胞克隆。收獲的病毒上清液轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，經(jīng)過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative。通過RT-PCR和免疫組化方法鑒定Her-2表達(dá)的抑制效果。 ③通過MTT檢測細(xì)胞

6、增殖以及對(duì)順鉑的敏感性，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡。 ④將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative及SKOV3種植到裸鼠皮下檢測成瘤情況，并觀察NK-92細(xì)胞對(duì)其殺傷作用。 結(jié)果: ①成功構(gòu)建Her-2/siRNA、Her-2/siRNA-negative重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。 ②建立了穩(wěn)定抑制Her-2基因表達(dá)的細(xì)胞株SKOV3/siRNA和對(duì)照組SK

7、OV3/siRNA-negative，SKOV3/siRNA組細(xì)胞Her-2基因表達(dá)為對(duì)照組的38.4％，免疫組化結(jié)果顯示Her-2基因表達(dá)受到較強(qiáng)抑制。 ③SKOV3/siRNA細(xì)胞株的G0/G1期細(xì)胞占(68.6±10.3)％，S期細(xì)胞占(15.1±1.2)％，G2/M期占(11.4±1.4)％；而SKOV3/siRNA-negative細(xì)胞株的G0/G1期細(xì)胞則占(55.8±9.1)％， S期細(xì)胞占(23.3±1.5)％，

8、G2/M期占(18.1±1.7)％。 ④SKOV3/siRNA細(xì)胞株早期凋亡(10.500±0.250)％、SKOV3/siRNA-negative細(xì)胞株早期凋亡(0.340±0.010)％，兩者比較，差異有顯著性(p<0.01)。 ⑤MTT檢測結(jié)果顯示SKOV3/siRNA組細(xì)胞增殖較SKOV3/siRNA-negative明顯下調(diào)(p<0.05)，接種于裸鼠皮下的腫瘤生長明顯減慢(p<0.01)。 ⑥對(duì)順鉑的

9、耐藥性研究：在DDP作用下SKOV3/siRNA細(xì)胞存活率在4d時(shí)為(66.4±3.3)％，與對(duì)照組(81.7±1.3)％比較差異有顯著性(p<0.05)。FCM分析顯示SKOV3/siRNA細(xì)胞的DDP誘導(dǎo)凋亡率為(42.84±1.4)％，明顯高于對(duì)照組組(8.8±0.7)％，差異有顯著性(p<0.01)。 ⑦NK細(xì)胞殺傷的研究：NK-92在效靶比1:20時(shí)對(duì)SKOV3/siRNA-negative、SKOV-3/siRNA細(xì)

10、胞殺傷率分別為(21.1±6.8)％和(45.5±8.9)％(p<0.05)，SKOV-3/siRNA細(xì)胞接種在裸鼠皮下形成的腫瘤生長速度慢于SKOV3/siRNA-negative (p<0.05)，在NK-92治療后其腫瘤生長速度顯著減慢(p<0.05)。 結(jié)論: ①由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的siRNA可以有效抑制Her-2基因的表達(dá)。 ②抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞的Her-2基因表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞株SKOV

11、3惡性生物學(xué)行為明顯受抑。 ③抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞的Her-2基因表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞株SKOV3對(duì)順鉑的敏感性增加。 ④抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞的Her-2基因表達(dá)后，可以增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞在體內(nèi)和體外的殺傷活性。因此，抑制Her-2基因的表達(dá)可以影響卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的惡性生物學(xué)行為，提高順鉑藥物敏感性，提高NK-92細(xì)胞的殺傷活性，NK-92細(xì)胞聯(lián)合靶Her-2基因的siRNA有望