HE4蛋白對人卵巢癌細胞系SKOV3生物學特性的影響及其機制研究.pdf

1、卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，死亡率居首位。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀，又缺乏有效的篩查手段，往往發(fā)現(xiàn)時已是晚期。多年來卵巢癌5年生存率一直徘徊在30％以下[1]，如果卵巢癌能夠早期發(fā)現(xiàn)并治療，其5年生存率可以提高到70～90％[1,2]。因此，為尋求有效的早期診斷和治療方案，卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機制一直是婦科腫瘤基礎與臨床研究探索的重點。
　　人附睪蛋白4(human epididymis protein4，HE4)是一種小分

2、子分泌型糖蛋白，從1991年發(fā)現(xiàn)至今，大量的臨床流行病學研究證實HE4對卵巢癌的早期診斷、療效檢測和預后評估具有重要價值，其敏感度和特異性優(yōu)于經典的卵巢癌標記物CA125[3-5]。然而，作為一種新型的腫瘤標志物，其表達增加的意義及機制還不清楚。目前有關HE4基因和蛋白功能的研究正在成為熱點。LeBleu VS等[6]以腎纖維化轉基因小鼠為模型，首次證實了HE4具有蛋白酶抑制劑的功能，拓展了人們對HE4功能的認識。然而對于HE4參與卵巢

3、癌發(fā)生發(fā)展的機制研究很少。本課題組利用基因重組技術構建了HE4基因的原核表達載體，成功表達并獲得了較高純度的重組HE4蛋白。為今后檢測HE4的互作蛋白、受體蛋白奠定基礎。我們同時購買了真核表達的重組HE4蛋白進行體外實驗。我們以卵巢腺癌細胞系SKOV-3作為模式細胞，將HE4蛋白作用于細胞，結果顯示，經HE4蛋白處理后，SKOV-3細胞的惡性生物學行為明顯增強，如細胞增殖能力增強，進入G2/M期的細胞比例明顯增加。我們在實驗中意外發(fā)現(xiàn)，

4、HE4蛋白處理后，SKOV-3細胞對化療藥卡鉑的耐藥性增強。通過檢測凋亡因子Bcl-2和Bax蛋白的表達水平，我們推斷，HE4對細胞耐藥行為的影響可能是通過調控Bcl-2家族成員的表達而實現(xiàn)的。我們進一步利用基因芯片技術篩選HE4處理前后SKOV3細胞的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)細胞對HE4蛋白的應答基因涉及廣泛的功能，包括周期調節(jié)，信號轉導，細胞增殖，凋亡，DNA修復，應激反應等。本研究有助于全面了解細胞對HE4蛋白的應答機制，以期為卵巢癌特

5、殊生物學行為和耐藥機制研究提供新的思路。
　　全文分下列兩部分:
　　第一部分重組HE4蛋白的原核表達和純化
　　目的:
　　重組及表達HE4融合蛋白。
　　方法:
　　以合成pcDNA3.1-HE4質粒為模板，用帶NcoⅡ/NotⅠ雙酶切位點的引物進行PCR擴增，將產物HE4片段與pET28a載體連接，轉化入DH5a菌中進行克隆并測序鑒定。進一步構建pET28a-HE4表達體系，用異丙基β-D-硫代

6、半乳糖苷(IPTG)誘導，在BL21菌中表達HE4融合蛋白(含有His-Tag)。蛋白經Ni2+-NTA層析柱純化后，進行SDS-PAGE分析鑒定。
　　結果:
　　1、成功構建了HE4融合蛋白的重組表達質粒。
　　2、在大腸桿菌中實現(xiàn)了HE4重組蛋白的可溶性高表達。
　　結論:
　　采用原核表達方法可獲得較高純度的HE4融合蛋白，為進一步研究HE4的生物學功能奠定基礎。
　　第二部分 HE4蛋白對人

7、卵巢癌細胞系SKOV3生物學特性的影響及其機制研究
　　目的:
　　HE4作為一種新型的腫瘤標志物已經廣泛應用在卵巢癌的診斷中。本實驗擬探討其對卵巢癌細胞系SKOV-3的生物學表型的影響及其作用機制。
　　方法:
　　檢測重組HE4蛋白處理后， SKOV3細胞增殖、周期分布和凋亡細胞比例的變化，并通過基因芯片技術探討HE4處理前后卵巢癌細胞相關基因的表達差異。
　　結果:
　　1、重組HE4蛋白刺激后