卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3中側(cè)群細(xì)胞的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究.pdf

1、背景與目的:卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率居于第三位的惡性腫瘤,僅次于子宮頸癌和子宮體癌,但卵巢癌的病死率是所有婦科腫瘤中最高的。其臨床癥狀不典型,發(fā)病部位隱蔽,易于轉(zhuǎn)移及廣泛播散。卵巢癌進(jìn)行剖腹探查術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占30％,大多數(shù)己擴(kuò)散到子宮雙側(cè)附件,大網(wǎng)膜及盆腔各器官,所以至今卵巢癌在診斷和治療上仍是一大難題,而且治療后極易復(fù)發(fā)。經(jīng)以手術(shù)為主的綜合治療以后5年存活率仍然徘徊在30％左右。這一狀況

2、近十年來未能改善,對婦女生命造成嚴(yán)重威脅,因此探索新的治療策略顯得極為迫切。
　　 近年來隨著對腫瘤研究的不斷深入,逐漸形成了腫瘤干細(xì)胞理論。人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中也存在等級現(xiàn)象,并且認(rèn)識(shí)到僅少量腫瘤細(xì)胞在惡性腫瘤發(fā)展過程中起到干細(xì)胞作用,它們具有不斷地自我更新和分化的能力,可以維持惡性腫瘤組織的不斷生長和轉(zhuǎn)移,還可以分化成各種腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞。但是腫瘤組織中其余大部分細(xì)胞在經(jīng)過短暫的分化后,即便沒有化療藥物的作用也會(huì)最終走向凋

3、亡或死亡。
　　 目前對腫瘤干細(xì)胞的研究越來越多,并在多種實(shí)體腫瘤中證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在。卵巢癌干細(xì)胞的研究對認(rèn)識(shí)卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷以及根治方法提示了新的研究方向。
　　 分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞是研究腫瘤干細(xì)胞的首要問題,但是如果缺乏特異的表面標(biāo)記物,腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定就變成一個(gè)難題。側(cè)群細(xì)胞(Sidepopulation cell,SP cell,SP細(xì)胞)是利用DNA熒光染料Hoechst33342和流式細(xì)

4、胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)的特殊細(xì)胞亞群,能通過.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將熒光染料Hoechst33342泵出細(xì)胞而呈弱染狀態(tài),并因此而得名。側(cè)群細(xì)胞可能是一種特殊類型的干細(xì)胞,具有自我更新、多向分化等一系列干細(xì)胞的生物學(xué)特征。至今人們已經(jīng)在多種實(shí)體腫瘤中分離得到了側(cè)群細(xì)胞。當(dāng)缺乏干細(xì)胞特異標(biāo)記的情況下,SP細(xì)胞分選和分析成為研究腫瘤干細(xì)胞的一種實(shí)用而重要的方法。
　　 最近的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞的另一重要特征是它們具有間質(zhì)細(xì)胞的特性,它們?nèi)菀壮霈F(xiàn)表皮

5、細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)。EMT現(xiàn)象是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的第一步,也是最重要的一步。阻斷腫瘤干細(xì)胞的EMT特性,有可能預(yù)防腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 本研究利用SP細(xì)胞的弱染特性將OVCAR-3細(xì)胞系中的SP細(xì)胞分選出來,并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究,為探索以腫瘤干細(xì)胞理論為基礎(chǔ)的新的卵巢癌治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:本研究中,首先用免疫細(xì)

6、胞化學(xué)方法分析了干細(xì)胞相關(guān)基因Oct3／4在OVCAR-3細(xì)胞中的表達(dá)。隨后將生長狀態(tài)良好的OVCAR-3細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選,通過對Hoechst33342濃度和染色時(shí)間的調(diào)整對SP方法進(jìn)行條件優(yōu)化。對比維拉帕米抑制實(shí)驗(yàn)在流式細(xì)胞儀上設(shè)門,分別收集熒光陽性的NSP細(xì)胞和熒光陰性的SP細(xì)胞,研究它們生物學(xué)性狀的差異,包括將分選后的兩個(gè)亞群的細(xì)胞分別接種到六孔板中,進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn),比較兩個(gè)亞群細(xì)胞克隆形

7、成能力是否存在差異:分別提取兩個(gè)亞群細(xì)胞的總RNA,進(jìn)行real-time PCR,比較兩個(gè)亞群細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因Oct3／4和EMT相關(guān)基因Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等的表達(dá)差異；用無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞,觀察它們的形態(tài)變化；用不同劑量的X射線照射分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞,比較其對X射線的抵抗能力。
　　 結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,OVCAR-3細(xì)胞系中的一小群細(xì)

8、胞表達(dá)Oct3／4蛋白,但與陽性對照精原細(xì)胞癌中Oct3／4蛋白的表達(dá)相比,OVCAR-3細(xì)胞中Oct3／4蛋白的表達(dá)非常微弱。
　　 進(jìn)行流式細(xì)胞分選時(shí),當(dāng)應(yīng)用5μg／ml的Hoechst33342對卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3進(jìn)行染色分析,結(jié)果重復(fù)數(shù)次均未發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用2.5μg／ml的Hoechst33342染色,37℃9陣育90min后上機(jī)分析,結(jié)果OVCAR-3細(xì)胞中出現(xiàn)了0.1％的SP細(xì)胞,且SP細(xì)胞經(jīng)維拉帕米作

9、用后數(shù)量減少或者消失。當(dāng)應(yīng)用1μg／ml的Hoechst33342染色,37℃孵育90min后上機(jī)分析,發(fā)現(xiàn)沒有明顯的SP細(xì)胞出現(xiàn)。
　　 隨后我們以不同的孵育時(shí)間與不同濃度的Hoechst33342相組合進(jìn)行分析,最終發(fā)現(xiàn),當(dāng)應(yīng)用2.5μg／ml的Hoechst33342染色染色60min,對照管中加入100μM的維拉帕米,37℃孵育60min后上機(jī)分析時(shí),結(jié)合維拉帕米抑制試驗(yàn),在OVCAR-3細(xì)胞系中設(shè)門,SP細(xì)胞最明顯,比

10、例為0.9％。隨后SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞被分選出來用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,分選出的細(xì)胞培養(yǎng)12天之后,形成的大部分克隆的細(xì)胞數(shù)能達(dá)到50個(gè)以上,SP細(xì)胞的克隆形成能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于NSP細(xì)胞,克隆形成率分別為(19.8±4.1)％和(3±1.3)％(P<0.01)。顯微鏡下見SP細(xì)胞有3種類型的克隆形成:Holoclones(形成克隆的細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞直徑較小,克隆直徑最大)、Paraclone(形成克隆的細(xì)胞疏散分布

11、,細(xì)胞直徑較大,克隆直徑較小)和Metoclone(介于Holoclone和Paraclone之間的克隆)。只有SP細(xì)胞能夠形成Holoclones,NSP細(xì)胞僅能形成幾個(gè)Paraclone和Metoclone。
　　 無血清細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞培養(yǎng)5天后,SP細(xì)胞表現(xiàn)出了明顯的間質(zhì)細(xì)胞特性,具體表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)大部分明顯拉長,呈明顯的成纖維細(xì)胞形態(tài),而NSP細(xì)胞的形態(tài)變化不明顯。
　　 Real-t

12、ime RT-PCR研究發(fā)現(xiàn),SP細(xì)胞與分選出的NSP細(xì)胞相比,Oct3／4表達(dá)更高(P<0.05)。并且與細(xì)胞形態(tài)變化相一致,SP細(xì)胞的N—cadherin和VemintinRNA的表達(dá)更高(P<0.05),而NSP細(xì)胞的E-cadherin RNA表達(dá)更高(P<0.05)。
　　 X射線照射敏感性檢測結(jié)果顯示,SP細(xì)胞對X射線照射的抵抗能力明顯強(qiáng)于NSP細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR