慢病毒載體介導(dǎo)的versicanRNAi對(duì)毛乳頭細(xì)胞凝集性生長影響的研究-.pdf

1、背景：
　　 毛囊是皮膚的重要附屬器，對(duì)于研究真表皮間的信號(hào)交換、傷口愈合和組織工程皮膚具有重要的生物學(xué)意義。位于毛囊基底部的毛乳頭細(xì)胞(DPCs)，作為毛囊組成的重要細(xì)胞，其凝集性生長是從胚胎毛囊發(fā)育過程中保留下來的一個(gè)重要特征，表現(xiàn)為細(xì)胞融合前呈多層聚集性生長，周圍細(xì)胞呈放射狀排列。因與誘導(dǎo)毛囊形成的能力密切有關(guān)，DPCs已成為研究毛囊發(fā)育、再生的重要對(duì)象。多能蛋白聚糖(versican)是一種大分子硫酸軟骨素蛋白聚糖，為D

2、PCs細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成份之一，其生物學(xué)功能是作為分子信號(hào)與水化分子，在細(xì)胞粘附、遷移和分化中發(fā)揮重要作用。我們在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)代次的增加，DPCs的凝集性生長逐漸消失，versican基因及蛋白的表達(dá)也隨之降低，表明versican基因的表達(dá)與DPCs凝集性生長密切相關(guān)。因此，DPCs凝集性生長與versican基因表達(dá)之間是否存在因果關(guān)系，是我們需要進(jìn)一步研究的重要內(nèi)容。這對(duì)于研究DPCs的凝集性生長和誘導(dǎo)毛囊形成的

3、機(jī)制，闡明毛囊形態(tài)發(fā)生和組織工程皮膚中毛囊重建等都具有十分重要的科學(xué)意義。
　　 目的：
　　 1.分離純化得到DPCs，誘導(dǎo)高代(第8代)DPCs重新出現(xiàn)凝集性生長。
　　 2.構(gòu)建versican RNAi的慢病毒載體。
　　 3.用構(gòu)建好的versican RNAi慢病毒載體感染低代(第2代)DPCs，觀察versican基因敲減后對(duì)DPCs凝集性生長的影響。
　　 方法：
　　 1

4、.采用我科建立的“二步酶消化法”分離培養(yǎng)正常人DPCs，觀察體外培養(yǎng)條件下DPCs形態(tài)和生長情況，并行α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)免疫染色鑒定。
　　 2.采用DMEM完全培養(yǎng)基加原代DPCs回收培養(yǎng)基，按1:1的比例培養(yǎng)第8代DPCs，誘導(dǎo)其重新出現(xiàn)凝集性生長現(xiàn)象的可行性；并行MTT、RT-PCR、western-blotting等方法檢測versican表達(dá)情況。
　　

5、 3.設(shè)計(jì)4種versican基因RNAi的靶點(diǎn)，經(jīng)酶切后與慢病毒載體相連，轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中進(jìn)行小量擴(kuò)增，并在靶細(xì)胞H1299中應(yīng)用qPCR和western-blotting方法篩選出最佳靶點(diǎn)，再大量擴(kuò)增，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 4.用篩選出的有versican基因RNAi的最佳靶點(diǎn)的慢病毒載體感染低代(第2代)DPCs，通過MTT、qPCR和western-blotting、鏡下觀察等方法觀察versican基因敲減對(duì)DPCs

6、凝集性生長的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用我科建立的“二步酶消化法”分離培養(yǎng)了正常人DPCs，單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)呈梭形，形態(tài)上類似成纖維細(xì)胞，但體積較大，具有明顯的多層凝集性生長特性，體外培養(yǎng)的DPCs表達(dá)特異性標(biāo)記物α-SMA。
　　 2.用DMEM完全培養(yǎng)基加原代DPCs培養(yǎng)時(shí)回收的培養(yǎng)基，按1:1的比例培養(yǎng)第8代DPCs，約3天左右，出現(xiàn)細(xì)胞的聚集性生長，約7天左右開始出現(xiàn)細(xì)胞凝集性生長的情況，細(xì)胞凝集成

7、團(tuán)，呈多層放射狀生長。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)第2代DPCs的增殖能力較第8代DPCs和成纖維細(xì)胞強(qiáng)(p<0.01)，RT-PCR和western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)第8代非凝集性生長、經(jīng)新鮮的原代培養(yǎng)基回收液誘導(dǎo)、重新形成了凝集性生長的DPCs與呈凝集性生長的第2代的DPCs，其mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于非凝集性生長的第8代DPCs和成纖維細(xì)胞(p<0.01)。
　　 3.構(gòu)建四個(gè)versican RNAi靶點(diǎn)，在靶細(xì)胞H1

8、299中經(jīng)qPCR和western-blotting對(duì)目的基因進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，4個(gè)靶點(diǎn)對(duì)versican基因及蛋白表達(dá)均有顯著敲減作用，效率均達(dá)到70％以上；2＃、3＃靶點(diǎn)敲減效率高達(dá)90％以上，其中尤以2＃靶點(diǎn)敲減效率最高，故將2＃確定為最佳靶點(diǎn)。
　　 4.用篩選出的有versican基因RNAi的最佳靶點(diǎn)--2＃靶點(diǎn)的慢病毒載體感染低代(第2代)DPCs，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，可見強(qiáng)綠色的熒光顆粒，轉(zhuǎn)染效率達(dá)80

9、～90％，細(xì)胞邊緣模糊，折光度明顯降低，形態(tài)略顯老化；qPCR及western-blotting檢測versican mRNA及蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，versican mRNA及蛋白的表達(dá)均低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組和成纖維細(xì)胞對(duì)照組(p<0.01)，而其余幾組比較則無顯著性差異；用MTT檢測發(fā)現(xiàn)感染病毒載體的DPCs的增殖能力明顯低于未感染病毒的DPCs，特別是在第三天以后，差異更加顯著(p<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　

10、 1.成功誘導(dǎo)了高代(第8代)DPCs重新出現(xiàn)了凝集性生長，其versican基因及蛋白表達(dá)增高。這說明DPCs凝集性生長時(shí)較非凝集性生長時(shí)，versican的表達(dá)要強(qiáng)。
　　 2.成功構(gòu)建了versican RNAi的慢病毒載體，經(jīng)qPCR及western-blotting檢測，干擾效果高達(dá)90％以上。
　　 3.低代(第2代)DPCs的versican行RNAi后，細(xì)胞的增殖能力明顯降低、細(xì)胞的形態(tài)老化，不再出現(xiàn)凝集