CALR基因在MDS患者中的表達(dá)及其RNAi慢病毒載體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響.pdf

1、目的：研究骨髓增生異常綜合征(MDS)患者中鈣網(wǎng)織蛋白基因(Calreticulin, CALR)的表達(dá)，并構(gòu)建CALR-RNAi慢病毒載體，觀察其對(duì)人MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響。
　　方法：收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科2010年~2014年的34例MDS患者骨髓標(biāo)本和8例非MDS患者骨髓標(biāo)本。按照WHO分型診斷標(biāo)準(zhǔn)和MDS國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)，將實(shí)驗(yàn)組34例患者分為高危組和低危組，對(duì)照組取另外8例同期非MDS患

2、者的骨髓標(biāo)本。所有骨髓標(biāo)本通過分離單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備為cDNA，使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組骨髓標(biāo)本及SKM-1細(xì)胞中CALR的相對(duì)表達(dá)水平。
　　首先查詢GenBank中CALR（human）的堿基序列，然后使用RNAi軟件設(shè)計(jì)3條RNAi靶序列、1條陰性對(duì)照序列。合成RNAi靶序列的單鏈DNA oligo，退火配對(duì)產(chǎn)生雙鏈，T4 DNA連接酶連接酶切后的慢病毒載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，PCR篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)

3、序鑒定，完成RNAi慢病毒載體的制備。共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝得到3種GV-CALR-RNAi重組慢病毒載體。病毒滴度采用逐孔稀釋法進(jìn)行測(cè)定。
　　三種GV-CALR-RNAi重組慢病毒分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SKM-1細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。后收集各組細(xì)胞，分別提取總RNA及蛋白，通過RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞CALR mRNA表達(dá)及Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞CALR蛋白質(zhì)的表達(dá)以驗(yàn)證干擾效果，篩選出最佳靶向序列

4、。使用含最佳靶向序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)干擾CALR基因的表達(dá)對(duì)SKM-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，流式細(xì)胞術(shù)觀察其對(duì)細(xì)胞周期的影響，Annexin V/7-AAD雙染法用流式細(xì)胞術(shù)觀察對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，Western blot檢測(cè)凋亡蛋白caspase-3的水平。
　　結(jié)果：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)34例低、高危MDS標(biāo)本的CALR表達(dá)，絕大多數(shù)標(biāo)本CALR基因表達(dá)明顯降低，顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）。

5、同時(shí)，檢測(cè)到人MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞中CALR表達(dá)較正常對(duì)照明顯降低（P<0.01）
　　構(gòu)建的3組 CALR-RNAi重組慢病毒轉(zhuǎn)染人 MDS細(xì)胞株SKM-1后，倒置顯微鏡下觀察GFP熒光逐漸增強(qiáng)，至培養(yǎng)第5天表達(dá)最強(qiáng)， CALR-RNAi(2)、CALR-RNAi(3)慢病毒干擾組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率均在70％以上，而CALR-RNAi(1)慢病毒干擾組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率在50%以下。
　　RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染

6、后第5天實(shí)驗(yàn)組 CALR-mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示CALR-RNAi(3)慢病毒載體與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比能有效降低 CALR mRNA表達(dá)水平[(0.40±0.11)，P＜0.01］。Western blot檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)，CALR-RNAi(3)能有效敲除CALR蛋白的表達(dá)，確定為最佳靶點(diǎn)
　　在SKM-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CALR-RNAi（3）慢病毒及陰性對(duì)照組慢病毒，通過CCK-8法檢測(cè)SKM-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)CALR

7、-RNAi(3)通過干擾CALR表達(dá)可促進(jìn)SKM-1細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)第5天統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞周期情況，結(jié)果顯示CALR-RNAi(3)組G0/G1期細(xì)胞比例（45.25±4.45）%低于空白對(duì)照組（54.12±1.36）%和陰性對(duì)照組（54.67±1.26）%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019，P=0.014）；而CALR-RNAi(3)組S期細(xì)胞比例細(xì)胞比例為（46.15±2.99）

8、，明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組[(38.42±2.11)%和（36.23±3.25）%，P<0.05。 AnnexinV/7-AAD雙染法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CALR-RNAi(3)組較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡減少（圖7），且有顯著性差異（P<0.05）。用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中cleaved-caspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比， cleaved-caspase-3的表達(dá)在