rBTI活性位點(diǎn)分析及其突變體的研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑(PI，protease inhibitor)在動(dòng)物、植物、微生物以及人類自身的代謝調(diào)控過程中起著非常重要的作用。抑制劑與蛋白酶的協(xié)同調(diào)節(jié)使體內(nèi)各種生理過程得以有條不紊的進(jìn)行。由于抑制劑功能的重要性與獨(dú)特性，越來越多的科研工作者開始將目光轉(zhuǎn)移到抑制劑的研究上。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)百種蛋白酶抑制劑相繼得到分離和鑒定，并且有多種抑制劑被證明具有治療腫瘤、人類獲得性免疫缺陷癥等惡性疾病的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　植物是各種蛋白酶抑制

2、劑的主要來源。在植物中，絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究最早，認(rèn)識(shí)也最為深入。根據(jù)抑制劑之間的序列同源性、活性位點(diǎn)位置以及二硫鍵數(shù)目，人們將植物來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑分為Bowman-Birk，Kunitz，PotatoⅠ，PotatoⅡ，Cucurbit，Cereal, Taumatin-like和Ragi A1等家族。目前的研究主要集中于Bowman-Birk家族、Kunitz家族和PotatoⅠ家族。
　　蕎麥屬于藥食同源作物，是

3、我國(guó)傳統(tǒng)的小雜糧作物。作為一種健康食品，蕎麥越來越受到人們的青睞。有研究證明，來自蕎麥中的蛋白酶抑制劑具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。我們先前的研究通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得了一種重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑(Recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI)，其生物學(xué)活性與天然BTI活性相近，研究表明，rBTI屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑中的PotatoⅠ家族。體外實(shí)驗(yàn)顯示，rBTI能誘導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常

4、細(xì)胞無副作用。rBTI作為一種功能性蛋白，對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究具有重要的理論意義及實(shí)際價(jià)值。
　　為了揭示rBTI結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，表征rBTI的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本研究依據(jù)序列比對(duì)和胰蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用定點(diǎn)突變方法將rBTI氨基酸序列中第45位Arg進(jìn)行突變，先后構(gòu)建了R45A-aBTI和R45F-fBTI兩個(gè)突變體。抑制活性實(shí)驗(yàn)顯示，突變體aBTI和fBTI均喪失了對(duì)胰蛋白酶的抑制活性，從而確定了rBTI的活性位點(diǎn)為Arg4

5、5。對(duì)突變體的抑制活性鑒定我們發(fā)現(xiàn)，aBTI和fBTI雖然失去了對(duì)胰蛋白酶的抑制作用，卻分別顯示出對(duì)彈性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。理化性質(zhì)分析表明，野生型抑制劑rBTI和兩個(gè)突變型抑制劑具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。MTT比色法以及細(xì)胞核形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，突變體aBTI和fBTI在體外仍然能有效抑制HL-60和EC9706腫瘤細(xì)胞的增殖，并且具有明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　本研究采用定點(diǎn)突變技術(shù)和理化性質(zhì)分析，不