野生型MxA蛋白及其突變體抑制HBV復(fù)制活性研究.pdf

1、研究背景： MxA蛋白由662個(gè)氨基酸殘基組成，是大GTP酶蛋白超家族成員和動(dòng)力素超家族成員，分子量為76KD。MxA蛋白有GTP酶活性，即該蛋白有結(jié)合GTP的活性和水解GTP能力。MxA蛋白通過N端氨基酸GTP結(jié)合元件結(jié)合外源性GTP；C端氨基酸含有GTP酶水解效應(yīng)區(qū)，能夠?qū)?nèi)源或外源GTP降解為GDP。 研究目的： 1、研究MxA蛋白在HepG2細(xì)胞中抑制HBV復(fù)制活性。 2、E645R變異是否影響M

2、xA蛋白抑制HBV復(fù)制活性。 3、GTP酶活性是否是影響MxA蛋白抑制HBV復(fù)制的關(guān)鍵因素。 4、MxA蛋白是否主要抑制HBV的核內(nèi)復(fù)制階段。 研究方法： 1、野生型和GTPase缺陷型MxA蛋白表達(dá)載體的鑒定：pcDNA3.1-Flag-MxA(wild-type)，pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A，pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612

3、K重組載體轉(zhuǎn)化DH5a，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過PCR鑒定和雙酶切鑒定后進(jìn)一步測(cè)序鑒定；測(cè)序結(jié)果與pubmed公布序列通過DNAsis軟件比對(duì)。用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)中量抽提以上各質(zhì)粒和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)。 2、野生型MxA蛋白抑制HBV復(fù)制活性研究：用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)大量抽提重組質(zhì)粒pU19-1.24HBV。常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。按5×1

4、06細(xì)胞/皿將細(xì)胞接種到直徑10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞貼壁后待轉(zhuǎn)染。 3、檢測(cè)Flag-MxA蛋白抑制HBV過程中是否發(fā)生降解：實(shí)驗(yàn)組取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重組質(zhì)粒分別為10μg和5μg共轉(zhuǎn)染；對(duì)照組取pcDNA3.1-Flag-MxA重組質(zhì)粒10μg，pU19質(zhì)粒和SalmonDNA共5μg共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，兩組pSeap質(zhì)粒均取0.3μg，轉(zhuǎn)染3天后，收集細(xì)胞裂解，蛋白定

5、量后westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Flag-MxA蛋白表達(dá)水平。 4、檢測(cè)Flag-MxA蛋白抑制HBV過程中是否發(fā)生重新分布：實(shí)驗(yàn)組取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重組質(zhì)粒分別為10μg和5μg共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞；對(duì)照組取pcDNA3.1-Flag-MxA重組質(zhì)粒10μg，pU19質(zhì)粒和SalmonDNA共5μg共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，3天后取出載玻片，常規(guī)方法使用anti-Flag單克隆抗體染

6、Flag-MxA蛋白，HO33342染細(xì)胞核，激光共聚焦觀察Flag-MxA蛋白在細(xì)胞核內(nèi)外分布。 5、E645R變異MxA重組載體(pcDNA3.1-Flag-MxAE645R)構(gòu)建：我們?cè)趐cDNA3.1-Flag-MxA重組質(zhì)?；A(chǔ)上采用定點(diǎn)突變獲得pcDNA3.1-Flag-MxAE645R重組質(zhì)粒。 6、E645R變異MxA蛋白抑制HBV復(fù)制活性研究：常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞接種到直徑10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培

7、養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞貼壁后待轉(zhuǎn)染。 7、GTP酶缺陷型MxA變異體對(duì)HBV復(fù)制的影響：常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞接種到直徑10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞貼壁后待轉(zhuǎn)染。 8、野生型MxA蛋白和T103A變異蛋白的核內(nèi)表達(dá)型重組載體(pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103)的構(gòu)建：pcDNA3.1-HA-MxA(wild-type)和pcDNA3.1-HA-MxA(T103A)兩種載體轉(zhuǎn)化DH5

8、α，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定后進(jìn)一步測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果與pubmed公布序列通過DNAsis軟件比對(duì)。 9、MxA蛋白核內(nèi)表達(dá)型抑制HBV復(fù)制研究：pcDNA3.1-HA-MxA(wild-type)和pcDNA3.1-HA-MxA(T103A)與各自核內(nèi)表達(dá)型載體(pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103)使用HiSpeedPlasmidMidiKit提取質(zhì)粒。 結(jié)果： 1

9、、MxA表達(dá)載體鑒定：pcDNA3.1-Flag-MxA(wild-type)，pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A，pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612K重組載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定并與PUBMED公布的人MxA序列比對(duì)表明各載體序列正確。定點(diǎn)突變獲得的pcDNA3.1-Flag-MxAE645R載體經(jīng)測(cè)序序列正確。pcDNA3.1-HA-MxAandpcDNA3.1-HA-

10、T103A經(jīng)酶切和測(cè)序表明序列正確；核內(nèi)表達(dá)型載體pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103測(cè)序結(jié)果也表明正確插入了SV40大T抗原核內(nèi)轉(zhuǎn)移信號(hào)肽。 2、野生型MxA蛋白抑制HBV復(fù)制結(jié)果：Westernblot檢測(cè)pcDNA3.1-Flag-MxA重組質(zhì)粒和pU19-1.24HBV重組質(zhì)粒按1:1、2:1共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞時(shí)，按2:1比例共轉(zhuǎn)染時(shí)MxA蛋白表達(dá)較1:1時(shí)強(qiáng)。與對(duì)照組相比，按1:1比例轉(zhuǎn)

11、染時(shí)MxA組HBeAg下降27％，HBsAg與對(duì)照組差別沒有顯著性意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染比例按2:1比例轉(zhuǎn)染時(shí)MxA組的HBeAg較對(duì)照組下降65％，差別有顯著性意義(P<0.01)；HBsAg與對(duì)照組下降21％(P<0.05)。各組上清進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)顯示1:1轉(zhuǎn)染時(shí)MxA組較對(duì)照組上清HBVDNA水平分別下降1.05個(gè)log10值，細(xì)胞內(nèi)HBVDNA下降0.68個(gè)log10值。2:1轉(zhuǎn)染時(shí)MxA組較對(duì)照組上清HB

12、VDNA水平下降1.91個(gè)log10值，細(xì)胞內(nèi)HBVDNA下降1.69個(gè)log10值。 3、抑制HBV復(fù)制時(shí)MxA蛋白的表達(dá)和分布：Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示MxA蛋白抑制HBV組與對(duì)照組MxA蛋白表達(dá)沒有明顯差別；激光共聚焦顯微鏡顯示在沒有HBV復(fù)制的HepG2細(xì)胞中Flag-MxA蛋白主要分布于細(xì)胞漿，而在HBV復(fù)制的HepG2細(xì)胞中Flag-MxA蛋白部分發(fā)生了核內(nèi)移。 4、MxA蛋白E645R變異載體抑制

13、HBV復(fù)制：Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明MxA組和E645R組有較好的Flag-MxA蛋白表達(dá)；MxA組和E645R組上清進(jìn)行abbott檢測(cè)顯示MxA組和E645R組HBsAg較對(duì)照組分別下降21％和24％；HBeAg分別下降65％和59％，差異具有顯著意義(P<0.01)。MxA組和E645R組間HBsAg和HBeAg表達(dá)水平差異沒有顯著性意義(P>0.05)。各組進(jìn)行realtimePCR檢測(cè)顯示MxA組和E645R組較對(duì)照

14、組上清HBVDNA水平分別下降1.91個(gè)和2.22個(gè)log10值，細(xì)胞內(nèi)HBVDNA分別下降下降1.69和1.70個(gè)log10值。 5、GTPase活性缺陷型載體對(duì)HBV復(fù)制的抑制：Westernblot結(jié)果顯示各組MxA蛋白均有較好的表達(dá)，對(duì)照無表達(dá)。與對(duì)照組相比，上清中的HBeAg在野生型組、K83A、T103A和L612K變異組的表達(dá)分別下降73％，71％，73％和70％(P<0.01)；上清的HBsAg水平在野生型組、K

15、83A、T103A和L612K變異組的表達(dá)分別下降41％，41％，44％和41％(P<0.01)；上清HBVDNA水平分別下降2.22，2.11，2.23和2.18log10(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)HBVDNA水平下降1.89，1.78，1.72和1.93log10(P<0.01)。在K83A、T103A和L612K變異組上清HBVDNA水平、HBsAg和HBeAg水平和細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA水平與野生型組比較差異沒有顯著性意義(P>0.

16、05)。 6、TMXA和T103抑制HBV復(fù)制的結(jié)果：Westernblot結(jié)果顯示各組均有較好的HA-MxA蛋白表達(dá)。激光共聚焦結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染TMxA和T103載體的HepG2細(xì)胞中，MxA蛋白主要以細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)為主；而胞漿型MxA載體和T103A載體在抑制HBV過程中僅部分核內(nèi)移，說明我們的核內(nèi)表達(dá)型載體提高TMxA的核內(nèi)表達(dá)濃度。與對(duì)照組相比，在MxA，TMxA,103和T103組，細(xì)胞外HBeAg水平下降28％，9％，2

17、8％和10％；細(xì)胞外HBVDNA水平分別下降88％，44％，88％和39％；細(xì)胞內(nèi)HBVDNA分別下降81％，350/o，76％和42％。TMxA和T103組細(xì)胞外HBeAg水平和胞內(nèi)胞外HBVDNA水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，但分別顯著高于MxA和103組的水平(P<0.01)。 結(jié)論： 1、MxA蛋白在HepG2細(xì)胞中抑制HBV復(fù)制；E645R變異不影響MxA蛋白抑制HBV復(fù)制活性。 2、MxA在抑