二氫楊梅素抑制致癌物誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞癌變與ATM基因甲基化的相關(guān)性研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,也是女性與癌癥相關(guān)死亡的首要原因。腫瘤的發(fā)生與原癌基因激活、抑癌基因沉默、DNA損傷修復(fù)缺陷等機(jī)制密切相關(guān)。某些抑癌基因在腫瘤發(fā)展過(guò)程中以各種不同的方式失活:如染色體的缺失,染色體插入或重排、單個(gè)堿基的突變或表觀遺傳改變?nèi)鏒NA甲基化。乳腺癌發(fā)生過(guò)程中相關(guān)基因異常的DNA甲基化破壞了基因的穩(wěn)定性,使其發(fā)生可遺傳的轉(zhuǎn)錄沉默。DNA甲基化在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要作用已被人們所認(rèn)可。此外,異常

2、的DNA甲基化在腫瘤發(fā)生過(guò)程中往往是一個(gè)早期事件,甚至比一些可見的病變更早發(fā)生。大多數(shù)的生命活動(dòng)都需要通過(guò)相應(yīng)的酶來(lái)催化調(diào)控,DNA甲基化的狀態(tài)的改變也不例外,因此對(duì)調(diào)節(jié)DNA甲基化狀態(tài)的酶進(jìn)行深入研究,對(duì)更好地了解DNA甲基化有重要意義。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化和維持的,主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1的主要作用是通過(guò)將甲基化信息傳遞給子代細(xì)胞,保持DNA甲基化模式的延續(xù);而DNMT

3、3a和DNMT3b主要參與調(diào)節(jié)DNA從頭甲基化。
　　ATM( ataxia telangiectasia mutated gene)是共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telangiectasi,AT)的突變基因,作為DNA損傷反應(yīng)系統(tǒng)的核心組成部份,常被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因,同時(shí)也被證實(shí)與乳腺癌的易感性有一定相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn),ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化與包括乳腺癌在內(nèi)的許多癌癥相關(guān)。由于甲基化是可逆的過(guò)程,可以通過(guò)去

4、甲基化作用從而恢復(fù)基因的表達(dá)和功能。大量研究證據(jù)表明環(huán)境致癌物的長(zhǎng)期暴露與乳腺癌發(fā)生有著密切聯(lián)系,而致癌物誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷是其致癌作用的重要病理基礎(chǔ),因此研究ATM這一與DNA損傷修復(fù)緊密相關(guān)的基因在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞癌變過(guò)程的變化,對(duì)于揭示乳腺癌發(fā)生的機(jī)制以及探索乳腺癌的預(yù)防控制措施具有重要意義。
　　越來(lái)越多的研究表明,膳食中的一些天然化合物可以通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性而改變癌細(xì)胞中DNA甲基化狀態(tài),從而使甲基化沉

5、默的抑癌基因恢復(fù)表達(dá)。二氫楊梅素(Ampelopsin,AMP)是從藤茶等植物的莖葉中提取的一種二氫黃酮醇類化合物,是一種天然膳食成分,已被報(bào)道具有廣泛的生物和藥理活性,如抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤等。但其抗癌作用的確切分子機(jī)制尚未明確,尤其是在腫瘤發(fā)生階段的作用研究較少。
　　基于以上分析,本研究采用人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A長(zhǎng)期暴露于低劑量的煙草及環(huán)境致癌物NNK和B[a]P建立體外乳腺癌變細(xì)胞模型,研究AMP對(duì)乳腺腫瘤

6、發(fā)生階段的影響,并觀察ATM基因甲基化在乳腺癌變過(guò)程的變化及AMP的干預(yù)效應(yīng),以探討AMP影響乳腺癌發(fā)生的潛在表觀遺傳機(jī)制。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.不同濃度(5_、10^M、20^M和40^M)AMP處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞48h后,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果顯示5^M AMP處理對(duì)MCF-7細(xì)胞活力無(wú)顯著影響,但10^M、20^M和40^M AMP處理的細(xì)胞活力隨處理濃度的增高而顯著下降(P<0.

7、05),AMP的IC5Q約為20pM。
　　2.100pmol/L NNK和100pmol/L B[a]P的化學(xué)致癌物聯(lián)合反復(fù)處理正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,隨著處理周期數(shù)的增加,細(xì)胞逐步具有一些腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性,具體表現(xiàn)為:生長(zhǎng)因子的依賴性逐漸降低,錨定非依賴性生長(zhǎng)能力和細(xì)胞劃痕愈合能力逐漸增強(qiáng),DNA損傷程度加強(qiáng)(yH2AX焦點(diǎn)數(shù)量增加),而20pM AMP與致癌物聯(lián)合作用時(shí),能夠抑制細(xì)胞發(fā)生上述細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。

8、
　　3.在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的MCF-10A乳腺細(xì)胞癌變模型中,致癌物組處理10、15個(gè)周期(P10、P15)時(shí),基因組整體DNA甲基化水平明顯降低(P〈0.05);而AMP與致癌物聯(lián)合處理組在整個(gè)致癌模型各時(shí)相點(diǎn)對(duì)基因組整體DNA甲基化水平無(wú)顯著性的影響。
　　4.致癌物處理組MCF-10A細(xì)胞的DNMT1酶活性及表達(dá)水平隨處理周期數(shù)的增加而顯著上升,20^M AMP與致癌物聯(lián)合處理組MCF-10A細(xì)胞的DNMT1酶活性及表

9、達(dá)水平則從P10起顯著下降。
　　5.計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接結(jié)果顯示,AMP可能通過(guò)與DNMT1結(jié)構(gòu)活性域特異性位點(diǎn)相結(jié)合,從而抑制其活性。
　　6.致癌物處理組MCF-10A細(xì)胞中ATM基因的表達(dá)水平明顯降低,而20^M AMP與致癌物聯(lián)合處理組ATM基因的表達(dá)水平則明顯升高,且相應(yīng)的變化具有時(shí)間依賴效應(yīng)。然而,與ATM相關(guān)的CHK2、RAD51和p53基因的表達(dá)水平在致癌物處理組細(xì)胞中無(wú)明顯改變,在AMP和致癌物聯(lián)合處理組則

10、隨處理代數(shù)增加而表達(dá)增強(qiáng)。
　　7.MSP檢測(cè)結(jié)果顯示,在致癌物處理的MCF-10A細(xì)胞中,隨處理周期數(shù)增加,ATM基因甲基化條帶(M條帶)亮度逐漸變強(qiáng),非甲基化條帶(U條帶)亮度逐漸減弱,提示致癌物使ATM基因啟動(dòng)子發(fā)生了一定程度的甲基化作用。經(jīng)AMP與致癌物聯(lián)合作用的MCF-10A細(xì)胞中,自P10開始,U條帶亮度明顯增強(qiáng),M條帶亮度則相應(yīng)減弱,表明AMP可顯著誘導(dǎo)ATM基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生去甲基化。
　　上述研究結(jié)果表明A