年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞Klotho基因的表達(dá)及甲基化水平初步研究.pdf

1、目的:
　　觀察正常人晶體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)晶體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell，LECs)中Klotho基因mRNA、蛋白表達(dá)情況及甲基水平，分析Klotho基因與ARC之間的關(guān)系，探討該基因的表觀遺傳變化在ARC發(fā)生中的調(diào)控機制。
　　材料與方法:
　　1.標(biāo)本收集:收集2013年9月至2014月10月在河南省人民醫(yī)院眼科行年齡相關(guān)性白內(nèi)障手術(shù)的

2、住院患者60例（患眼60只），均選擇第3期成熟期皮質(zhì)性白內(nèi)障。術(shù)前排除糖尿病、高血壓、心臟病等全身疾患，并排除虹膜睫狀體炎、青光眼、限外傷，以及長期眼放射線接觸等眼病史，男女不限。實驗分組為成青年透明晶體（A組18-30歲，平均年齡，mean±SD，25.00±3.97歲）30例(30眼)，男13例，女17例;中年ARC組（B組40-49歲，平均年齡，mean±SD，45.33±3.15歲）30例（30眼）男11例，女19例;老年ARC

3、組（C組67-85歲，平均年齡，mean±SD，75.53±5.76歲）30例（30眼），男12例，女18例。術(shù)前由同一醫(yī)生檢查和記錄患者性別、年齡、晶狀體混濁程度和類型。白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)由同一醫(yī)生進行，術(shù)中常規(guī)連續(xù)環(huán)形撕囊，直徑約5.5mm。正常人晶體(normaltransparent group)前囊膜來源于河南省立眼科研究所眼庫角膜移植術(shù)后透明晶體眼球，顯微鏡下同樣方法留取正常青年人晶狀體前囊膜作為對照組。所有晶體前囊膜置于P

4、BS緩沖液中沖洗，排除血液、虹膜色素、晶體皮質(zhì)、玻璃體等眼內(nèi)組織的附著。以上取材均通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。將獲得樣品立即置與-80℃冰箱保存。進行基因、蛋白及甲基化檢測。
　　2.Klotho基因RT-PCR檢測mRNA:將收集的晶體前囊膜迅速加入Trizol的Eppendofff管，PBS沖洗，離心沉淀5×105個細(xì)胞，去上清，加入細(xì)胞裂解液，離心5min，吸盡液體，干燥RNA，1min，加入焦碳酸二乙酯(diethyp

5、yrocarbonate，DEPC)水溶解，-80℃冷凍保存。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:測得比值在0.6～1.19之間。普通瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質(zhì)量鑒定:(1)制備瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻，加熱時應(yīng)蓋上封口膜。(2)膠板的制備:將膠槽置于制膠板上，插上樣品梳子，觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡;待凝膠冷卻

6、凝固后，垂直輕拔梳子;將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液面剛高出瓊脂糖凝膠面。(3)加樣:在薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)為2X。用10μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)。4.電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。(5)觀察和拍照:電泳完畢，取出凝膠。電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘，于

7、凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。引物設(shè)計:利用網(wǎng)絡(luò)資源GenBank(Klotho ID:16591; Klotho mRNA:NM-013823.1)獲得人Klotho基因序列，使用軟件Primer Prem ier5.0設(shè)計特異性引物，正義:5'-ACCTGGTGGCGCACAC，反義:5'-TTGGCAAACCAACCTAGTACA;GAPDH正義:5'-GAAGGTGAAGGTCG GAGT,反義5'-GAAGATGGTGATGGG

8、ATTTC。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:20℃10min，42℃60min使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，70℃10min滅火反轉(zhuǎn)錄酶，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。RT-PCR的檢測:常規(guī)PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)濃度瓊脂糖凝膠電泳成像分析，目的條帶清晰，且沒有雜帶，說明引物設(shè)計合成無誤，可以進行熒光定量PCR。實時熒光定量PCR的檢測:由美國ABI公司合成TaqMan探針，熒光定量PCR儀上進行擴增。Klotho-PCR基因的反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液(Mg2+

9、free)3.0μl;MgCl2(25mmol/L)1.8μl; dNTP(25mmol/L)0.36μl;上游引物（10μmol/L）1.0μl;下游引物(10μmol/L)1.0μl; Taq酶(5U/μl)。進行溶解曲線分析及瓊脂糖凝聚電泳驗證擴增。每個樣本均檢測3次，取其平均值，用2-ΔΔCt法計算KlothomRNA在不同組別標(biāo)本中的表達(dá)變化。
　　3.免疫組化染色（immunohistochemistry，IHC）:將

10、收集的晶體前囊膜標(biāo)本PBS液沖洗后，細(xì)胞面朝上平鋪于載玻片上，空氣干燥，ABC法染色，室溫下1:200山羊抗人Klotho抗體過夜，二抗驢抗羊1∶50作用2小時，在DAB反應(yīng)液中作用5min，PBS液沖洗、終止染色，干燥后封片。結(jié)果判定:隨機選取5個視野，計數(shù)50個細(xì)胞，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞百分率。陽性細(xì)胞比例的評分方法為:0分（陽性細(xì)胞比例≤5％），1分（5％＜陽性細(xì)胞比例≤25％），2分(25％＜陽性細(xì)胞比例≤50％)，3分

11、（50％＜陽性細(xì)胞比例≤75％），4分（75％＜陽性細(xì)胞比例≤100％）。細(xì)胞的染色強度可分為0分（染色陰性），1分（淡黃色顆粒），2分（棕黃色顆粒），3分（褐色顆粒）;按照染色強度與陽性細(xì)胞比例綜合計分，根據(jù)上述2項結(jié)果乘積的分?jǐn)?shù)分為4級，分?jǐn)?shù)≤g記為-，4＜分?jǐn)?shù)≤8記為+，8＜分?jǐn)?shù)＜12記為++，分?jǐn)?shù)=12記為+++。其中“-”記為Klotho表達(dá)陰性;“+”，“++”，“+++”記為Klotho表達(dá)陽性。
　　4.甲基化特異

12、性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)檢測Klotho甲基化水平分別提取3組標(biāo)本的DNA，取500ng DNA進行亞硫酸鹽處理，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit，取處理后的DNA1ul作為模板使用TaqGold DNA聚合酶進行甲基化特異性PCR擴增，反應(yīng)體系12.5ul，反應(yīng)條件:95℃變性10min，然后變性95℃30S，退火5

13、8℃30s，延伸72℃30S，共40個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，在紫外檢測儀上觀察產(chǎn)物條帶。用MethPrimer軟件設(shè)計甲基化與未甲基引物:分別設(shè)計甲基化特異PCR引物(Klotho M primer)和非甲基化特異PCR引物(Klotho U primer)進行PCR反應(yīng)。用甲基化特異引物進行PCR時，CpG島C堿基甲基化的DNA能產(chǎn)生特異PCR條帶，C堿基未甲基化的DN

14、A則不能產(chǎn)生PCR條帶。通過觀察klotho基因在人晶體上皮細(xì)胞中甲基化和非甲基化特異引物PCR擴增情況來判斷是否甲基化陽性。引物信息為Klotho(M)正義:5'-GTCGTCGTTGTAGTTCGTTATC，反義:5'-CAACAAACGCCGATAATAACG。Klotho(U)正義:5'-TTGTTGTTGTTGTACTTTGTTATT反義:5'-CCAACAAACACCAATAATAAC。(M):甲基化引物;(U):非甲基引物

15、。
　　4.統(tǒng)計學(xué)處理采用IBM SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，當(dāng)方差不齊時，采用Welch法進行組間比較;計數(shù)資料給出頻數(shù)及百分比，組間比較采用x2檢驗;等級資料給出百分比及平均秩次，組間比較采用Kruskal-Wallis法。
　　結(jié)果:
　　1.Klotho基因在晶體上皮的表達(dá)水平:Klotho基因在正常青年人晶體組、中年白內(nèi)障組

16、及老年白內(nèi)障組相對表達(dá)量分別是（mean±SD）:1.097±0.140，0.023±0.004，0.004±0.002，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.Klotho蛋白在晶體上皮細(xì)胞的表達(dá)水平:正常青年人晶體組Klotho蛋白呈陽性、均勻表達(dá)，表達(dá)部位位于胞漿及胞膜，中年白內(nèi)障組表達(dá)呈弱陽性，位于晶體前囊膜邊緣位置，DAB顯色反應(yīng)不均一，細(xì)胞形態(tài)變異，有偽足樣突起。老年白內(nèi)障組表達(dá)呈陰性。3組比較差異有顯著性(P＜0

17、.05)。
　　3.Klotho基因甲基化表達(dá)水平:透明晶體組、中年白內(nèi)障組及老年白內(nèi)障組甲基化發(fā)生率分別是3.3％，56.7％，93.3％。白內(nèi)障組甲基化發(fā)生率較透明晶體組明顯增高，差異有顯著性(P＜0.05)。Klotho基因甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系:透明晶體組(A)低甲基化，老年年齡相關(guān)性白內(nèi)障組(C)出現(xiàn)高甲基化，三組比較甲基化陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病機制是個